姜黄素对实验性肝纤维化大鼠肝损伤的保护作用

2015-11-29 04:52李开济骆广玲魏静波李保卫何红伟甄永占
吉林大学学报(医学版) 2015年2期
关键词:药组姜黄胆管

魏 洁,李开济,骆广玲,魏静波,李保卫,何红伟,甄永占

(1.卫生部北京医院 卫生部北京老年医学研究所,北京 100730;2.河北联合大学基础医学院组织学与胚胎学教研室,河北 唐山 063000;3.开滦医疗集团林西医院妇产科,河北 唐山 063000;4.中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所肿瘤室,北京 100050)

姜黄素是一种从姜科植物姜黄等的根茎中提取得到的酸性多酚类物质,主链为不饱和脂族及芳香族基团。姜黄素具有抗炎、抗氧化、抗纤维化和抗肿瘤等药理作用[1-3],在疾病防治中得到广泛应用。既往多采用四氯化碳诱导大鼠肝纤维化模型研究其作用。本研究探讨姜黄素对胆管结扎所致肝纤维化损伤大鼠的保护作用,初步阐明姜黄素保肝的作用机制,为姜黄素在胆汁淤积性肝脏损害治疗中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、主要试剂和仪器 Sprague-Dawlay大鼠21只,雄性,体质量290~310g,合格证号:SYXK(冀)2010-0038,购自斯备福动物中心,在恒温(22℃)、相对湿度65%~70%、光照周期12h∶12h环境中适应饲养1周后进行实验。姜黄素(陕西旭煌植物科技有限公司),HE染色试剂盒和Massion染色试剂盒(北京经科宏达生物技术有限公司),丙氨酸氨基转移酶(aminotransferase,ALT)检测试剂盒和天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所),α-Sma抗体和β-Actin抗体(美国Sigma公司),Tgf-β1(美国Epitomics公司),辣根过氧化物酶偶联二抗(北京中杉金桥公司)。可见光成像系统(日本Olympus公司),FAITH-4060全自动生化分析仪(中国南京劳拉电子有限公司),Spectra Max 190酶标仪(美国Molecular Device公司),伯乐电泳转印系统(美国Bio-Rad公司);Chemilmager 5500凝胶成像系统(美国Alpha Innotech公司)。

1.2 大鼠胆管结扎肝纤维化模型的建立 14只大鼠实验前禁食12h,水合氯醛麻醉,无菌操作下行上腹正中切口,抬高肝缘,拉开十二指肠,分离总胆管2~3cm,穿刺抽出胆汁证实。在近十二指肠处和近肝门处用2号丝线各结扎2次,从中间剪断胆总管。动物麻醉清醒后,正常进食,自由饮水,肌注青霉素,每日1次,共3d,以防感染。手术后大鼠体质量明显减轻,活动、摄食减少,鼠毛无光泽,皮肤黄染等,说明造模成功。

1.3 动物分组和处理 将造模成功的14只大鼠分为肝纤维化模型组和姜黄素给药组,每组7只。未进行胆管结扎的7只大鼠作为假手术组,造模后2d开始给药,假手术组和肝纤维化模型组大鼠分别给予生理盐水,姜黄素给药组大鼠给予姜黄素400mg·kg-1,使用前用0.5%羧甲基纤维素钠配制成混悬液,每天1次,给药14d。

1.4 各组大鼠肝功能检测 末次给药后24h(禁食不禁水12h),大鼠麻醉后腹主动脉取血,分离血清,严格按照试剂盒说明书操作,采用全自动生化分析仪检测ALT、AST活性和总胆红素(total bilirubin,Tbil)水平。处死大鼠取肝脏,肝脏在4℃ 预冷的生理盐水中反复清洗,置于冰上,取肝大叶纵切(每个肝取的位置大致相同)1~2mm厚肝组织置于10%中性甲醛溶液中固定。剩余肝组织分别切成小块,置于液氮中,冻透后转入-80℃冰箱中备用。

1.5 HE和Massion染色检测大鼠肝脏组织病理形态学 10%中性甲醛固定大鼠肝脏组织,经乙醇梯度脱水,常规石蜡包埋,石蜡切片(5μm)后分别行HE和Massion染色。显微镜下观察并拍照。

1.6 Western blotting法检测各组大鼠肝脏组织中转化生长因子β1(transforming growth factorbeta1,Tgf-β1)和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-Sma)蛋白表达水平 冻存的肝脏组织加入新鲜配制的组织裂解液(137mmol·L-1NaCl,20mmol· L-1Tris,pH =7.4,1%NP40,20%glycerol,10mmol· L-1PMSF,1mmol·L-1Na3VO4,10mmol· L-1NaF,2.5mg·L-1aprotinin,2.5mg·L-1leupetin,phosphotase inhibitor cocktail),4℃匀浆,冰上裂解15min,离心(4 ℃、12000r·min-1)20min,取上清,BCA法测Tgf-β1和α-Sma蛋白表达水平。等量蛋白(40μg)于10% 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后,电转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,5%脱脂牛奶37℃封闭1h,分别加入抗α-Sma、抗Tgf-β1及抗β-Actin抗体,4℃孵育过夜。洗涤10min×4次,用含辣根过氧化物酶(HRP)标记的相应二抗(1∶5000)孵育1h,洗膜15min×4次,膜上滴加化学发光增强剂,按照试剂说明进行操作,结果在凝胶成像仪上照相并使用Bio-Rad公司Quantity One分析软件测量条带灰度值,目的条带与β-actin条带灰度值比值即为该目的蛋白的相对表达水平。

1.7 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。各组大鼠血清中AST、ALT活性和Tbil水平及大鼠肝脏组织中Tgf-β1和α-Sma蛋白表达水平以表示,组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清中AST、ALT活性和Tbil水平 与假手术组比较,肝纤维化模型组和姜黄素给药组大鼠血清中AST、ALT活性和Tbil水平明显升高(P<0.05);与肝纤维化模型组比较,姜黄素给药组大鼠血清中AST、ALT的活性和Tbil的水平降低(P<0.05)。见表1。

2.2 大鼠肝脏组织病理形态学 HE染色:与假手术组比较,肝纤维化模型组大鼠肝细胞中可见大量胆管增生,姜黄素给药组大鼠胆管增生明显减少。所有大鼠肝脏组织炎细胞浸润均不明显;大鼠肝板结构均未见明显破坏。见图1(插页一)。

表1 各组大鼠血清中AST、ALT活性和Tbil水平Tab.1 Activities of AST,ALT,and levels of Tbil in serum of rats in various groups (n=7,)

表1 各组大鼠血清中AST、ALT活性和Tbil水平Tab.1 Activities of AST,ALT,and levels of Tbil in serum of rats in various groups (n=7,)

*P<0.05compared with sham operation group;△P<0.05 compared with model group.

)Group AST[λB/(U·L-1)]ALT[λB/(U·L-1)]Tbil[cB/(μmol·L-1eration 102.0±19.2 31.4±6.5 0.1±0.1 Model 985.8±187.4*218.5±68.7*159.8±17.6*Curcumin 656.0±171.9△151.1±72.7*△140.0±6.4*]Sham op△

2.3 大鼠肝脏组织胶原沉积 Massion染色:与假手术组比较,肝纤维化模型组大鼠肝细胞中可见大量胆管增生外,还可见明显胶原沉积,胶原纤维自中央静脉及汇管区向周围延伸,形成较粗的纤维间隔;姜黄素给药组大鼠胆管增生明显减少,还可见胶原沉积明显改善。见图2(插页一)。

2.4 Western blotting法检测大鼠肝脏组织中Tgf-β1和α-Sma蛋白表达水平 与假手术组比较,肝纤维化模型组大鼠肝脏组织中Tgf-β1和α-Sma蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。与肝纤维化模型组比较,姜黄素给药组大鼠肝脏组织中Tgf-β1和α-Sma蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。见图3和表2。

图3 Western blotting法检测各组大鼠肝脏组织中Tgf-β1和α-Sma蛋白表达电泳图Fig.3 Electrophoregram of expressions of Tgf-β1and α-Sma proteins in liver tissue of rats in various groups detected by Western blotting method

3 讨 论

肝纤维化是肝脏对各种原因所致肝损伤的创伤愈合反应,表现为肝内结缔组织增生与沉积,肝纤维化是大多数慢性肝病共有的病理特征,是慢性肝炎向肝硬化发展的必经病理过程[4],目前对肝纤维化的治疗尚无安全有效的药物,而近年来中药及天然产物在肝纤维化治疗中的疗效日益受到重视[5-7]。其中姜黄素对肝纤维化的作用及机制的研究已成为国内外研究的热点[8-12]。本研究采用胆管结扎方法诱导胆汁淤积性肝纤维化动物模型,观察姜黄素对胆管结扎所致肝纤维化损伤的保护作用,并探讨姜黄素保肝的作用机制。

表2 各组大鼠肝脏组织中Tgf-β和α-Sma蛋白表达水平Tab.2 Expression levels of Tgf-β1andα-Sma proteins in liver tissue of rats in various groups (n=7,)

表2 各组大鼠肝脏组织中Tgf-β和α-Sma蛋白表达水平Tab.2 Expression levels of Tgf-β1andα-Sma proteins in liver tissue of rats in various groups (n=7,)

*P<0.05compared with sham operation group;△P<0.05 compared with model group.

Group α-Sma Tgf-β1 Sham operation 1.0±0.4 1.0±0.3 Model 2.0±0.4* 2.8±0.4*Curcumin 1.0±0.2△ 2.0±0.2△

ALT和AST是反应肝细胞受损的指标,ALT主要存在于肝细胞浆中,肝细胞受损时,大量ALT被释放入血液而活性增高。80%的AST存在于线粒体内,当肝细胞线粒体大量破坏,血液中AST水平显著增加。ALT和AST水平升高反映肝细胞受损,其增高程度越大,病变越严重。本研究结果显示:与假手术组比较,胆管结扎所致的肝纤维化模型大鼠存在明显肝功能异常(ALT、AST活性增高和Tbil水平升高),应用姜黄素治疗后大鼠ALT、AST活性和Tbil水平降低。

HE和Massion染色结果显示:与假手术组比较,肝纤维化模型组大鼠肝细胞中可见大量胆管增生,胶原沉积明显;姜黄素给药组大鼠胆管增生明显减少,还可见胶原沉积明显改善。

本研究结果表明:Tgf-β1在肝纤维化的发生发展过程起着重要作用[4,13-17],通过活化肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC),促进细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成与沉积而致肝纤维化,是肝纤维化重要的始动因子之一,而肝纤维化的中心环节是HSC的活化,活化的HSC具有增殖、收缩、迁移、促进炎症和纤维生产活性,并表达α-Sma[4],α-Sma是 HSC 活化的标志。本研究结果显示:肝纤维化模型大鼠肝脏组织中Tgf-β1和α-Sma表达水平明显增高,表明姜黄素能够明显抑制 Tgf-β1和α-Sma表达。

综上所述,姜黄素能够抑制Tgf-β1诱导的HSC合成与分泌ECM,促进ECM降解,减少ECM在肝脏中的沉积,进而发挥治疗肝纤维化的作用。姜黄素有望成为胆汁淤积性肝纤维化的预防和治疗药物。

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