miR－18a对结直肠癌SW116细胞辐射敏感性的影响

燕蒙蒙，徐 珊，高 岩，刘 扬，贺梦子，陈司霖，李鹏武，刘晓冬，马淑梅

（1.吉林大学公共卫生学院 卫生部放射生物学重点实验室，吉林 长春 130021；2.吉林大学第一医院肿瘤中心放疗科，吉林 长春 130021）

结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率仅次于食管癌和胃癌［1］。但由于肿瘤的侵袭性生长，肿瘤难以切除干净，因此术后放疗已作为临床常规治疗手段。但由于许多结直肠癌对辐射并不敏感，常导致治疗失败，因此提高肿瘤细胞对放疗的敏感性，降低放疗对正常细胞带来的危害一直是医学工作者努力的方向。由于肿瘤生物治疗的发展和肿瘤细胞对放疗耐受机制的研究，目前已将两者联合起来用于肿瘤的治疗。较多研究［2－6］证实：miR－18a具有癌基因的作用，在乳腺癌、神经胶质瘤、胰腺癌、肝癌、鼻咽癌、前列腺癌和结肠癌中均为高表达。miR－18a在结肠癌组织、癌旁正常组织和结肠癌患者大便中作为肿瘤生物标志物均有报道［7－9］，但在结肠癌细胞中的表达鲜有报道。本研究选用结直肠癌SW116细胞作为研究对象，检测SW116细胞中共济失调－毛细血管扩张突变基因（ataxia－telangiectasia mutated，ATM）表达水平，研究在电离辐射情况下，miR－18a对结直肠癌细胞辐射敏感性的影响，以期为结直肠癌临床放疗增敏提供潜在的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂及仪器 结直肠癌SW116细胞和HEK－293细胞由吉林大学公共卫生学院放射生物学重点实验室提供。miR－18a引物、miR－18a NC（阴性对照）和miR－18amimics由上海吉玛制药技术有限公司合成，pRL－SV40和Dual－Luciferase Report Assay购自美国Promega公司，DMEM培养基购自美国Gibco公司，LipofectamineTM2000购于美国Invitrogen公司，Western blotting抗体ATM购自美国Cell Signal公司，qPCR试剂盒购自Takara大连宝生物公司。实时荧光定量PCR仪购自美国Stratagene公司。

1.2 细胞培养及转染 SW116细胞和HEK－293细胞培养于含10%FBS胎牛血清DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2条件下，将处于对数生长期的SW116细胞和HEK－293细胞消化，以每孔2×105接种至6孔板，继续培养24h待细胞长至培养板60% ～70%融合时转染。按说明书将7.5μL LipofectamineTM2000与 miR－18amimic及其阴性对照序列各20μmol·L－1混合后加入板孔中。4h后补含10%胎牛血清的DMEM培养液0.5mL。转染后24h收集细胞行后续实验。

1.3 照射条件 X线照射射：Philips深部X射线治疗机，电流18mA，电压180kV，靶皮距60cm，吸收剂量率0.344Gy·min－1。

1.4 q－RT PCR法检测 miR－18a表达 按照说明书，分别加入反应所需试剂、miR－18a特异性引物和cDNA样品，采用U6作为内参基因，进行PCR扩增从而检测 miR－18a的表达。按照miScript SYBR Green PCR Kit试剂盒说明书，在Mx3000实时荧光定量PCR仪上完成。结果采用比较阈值法计算，即目的基因的量＝2－△△CT，△△CT＝（实验组目的基因Ct－实验组管家基因Ct）（对照组目的基因Ct－对照组管家基因Ct）。

1.5 集落形成实验检测细胞的辐射敏感性 细胞转染24h后经胰酶消化后制成单细胞悬液，接种于6孔板中给予不同剂量X射线（0、2、4、6和8Gy）照射，每个剂量点接种的细胞数分别为500、1000、1500、3000和5000个，每个剂量点设3个平行样本。照射后置于培养箱中继续培养12～14d。用无水甲醇固定细胞，吉姆萨染色，显微镜下计数细胞的克隆数≥50个。采用Origin 8.0拟合剂量存活曲线，并计算出平均致死剂量（D0）、准阈剂量（Dq）、2GyX线照射的存活分数（SF2）和放射增敏比（SERD0）值。SERD0定义为阴性对照组D0和照射组D0之比。

1.6 GFPLC3形态学方法检测细胞自噬率 用磷酸钙转染的方法将PQN－GFP－LC3载体转染至SW116细胞，G418筛药（终浓度为900mg·L－1）14d，建立GFPLC3稳转模型。转染后32h进行照射，48h后用GFPLC3形态学方法检测自噬率，将含有10个以上自噬小体的细胞认为是自噬阳性细胞。结果由3名实验员按盲法分别独立计数。

1.7 流式细胞术检测SW116细胞凋亡率 将SW116细胞接种于6孔培养板中，接种密度为每孔2.0×105个，分为 miR－18aNC组、miR－18a mimic组，每组3个复孔，细胞转染后32h，2组细胞给予4Gy X线照射，48h后收集细胞，1500r·min－1离心5min，0.01mol·L－1PBS洗细胞2次，弃上清，过滤，每管加入Annexin V和PI各5μL，混匀，室温避光反应20min，上机检测，每个样品收集1.0×104个细胞。SW116细胞凋亡率以各期细胞百分率表示。

1.8 生物信息学预测及靶基因验证 应用生物信息学软件Union of miRBase Targetv4、TargetScan和PicTar 4.0对miR－18a的靶基因进行预测。

1.9 荧光素酶报告基因分析SW116细胞的pmiRATM荧光素酶活性 SW116细胞以每孔3×104个接种于24孔板，每孔共同转染20ng pmiRATM 3’UTR和5ng pRL－SV40，并同时共转染100nmol·L－1miR－18amimic或者 miR－18aNC，每组转染4个复孔。转染后48h应用试剂Dual－Luciferase Report Assay检测试剂盒检测。以firely luciferase activity／Renilla luciferase activity的比值计算荧光素值。

1.10 Western blotting法检测SW116细胞中ATM蛋白表达 提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，检测ATM蛋白的表达水平。

1.11 统计学分析 采用SPSS 15.0统计软件进行统计学分析。SW116细胞D0、Dq、SF2、SERD0、细胞凋亡率和自噬率以表示，两样本组间比较采用t检验和χ2检验。

2 结 果

2.1 SW116细胞中 miR－18a的表达 经qRTPCR检测，与正常人胚肾HEK－293细胞（1.00±0.08）比较，SW116细胞中 miR－18a呈高表达（1.95±0.03）（t＝17.4，P＜0.01）。经4GyX线照射后，SW116细胞中 miR－18a表达水平（1.71±0.10）低于0GyX线照射的SW116细胞（t＝25.0，P＜0.05）。

2.2 细胞辐射敏感性 miR－18aNC组和miR－18a mimic组克隆形成后，细胞存活分数及细胞存活曲线见表1和图1。与miR－18aNC组比较，miR－18a mimic组细胞的D0、Dq和SF2值均降低，其中D0值与miR－18aNC组SW116细胞D0值比较差异有统计学意义（P＜0.05），放射增敏比为1.30。

表1 各组SW116细胞的辐射增敏参数Tab.1 Radiosensitization parameters of SW116cells in various groups （）

表1 各组SW116细胞的辐射增敏参数Tab.1 Radiosensitization parameters of SW116cells in various groups （）

＊P＜0.05compared with miR－18aNC group.

Group D0 Dq SF2 SERDo miR－18aNC 2.23±0.33 1.28±0.14 0.56±0.18—miR－18amimic 1.72±0.10＊1.23±0.24 0.51±0.26 1.30±0.21

2.3 SW116细胞自噬率 经荧光显微镜鉴定转染成功，与 miR－18aNC组（8.0%±13.0%）比较，miR－18amimic组SW116细胞的自噬率（32.0%±2.0%）显著增加（P＜0.05），与 miR－18aNC＋4Gy组比较，miR－18amimic＋4Gy组SW116细胞自噬率（44.0%±2.0%）明显增加（P＜0.05）。见图2（插页二）。

2.4 SW116细胞凋亡率 流式细胞术检测，与miR－18aNC组（3.37% ±0.18%）比较，miR－18amimic组细胞凋亡率（5.94%±0.25%）增加58%（P＜0.05）；miR－18amimic＋4Gy组细胞凋亡率（6.82%±0.28%）明显高于 miR－18aNC＋4Gy组（5.00%±0.22%）（P＜0.05）。

2.5 miR－18a的靶基因预测及验证 荧光素酶报告基因分析实验，与miR－18aNC组（1.00±0.02）比较，miR－18amimic组SW116细胞pmiRATM 荧光素酶活性的相对值（0.81±0.01）明显降低（P＜0.05），miR－18a可明显抑制 pMIRATM荧光素酶的活性。ATM是miR－18a的靶基因。

2.6 SW116细胞中ATM蛋白的表达 Western blotting法检测，与miR－18aNC组比较，miR－18a mimic组SW116细胞中ATM蛋白表达减少；与miR－18aNC＋4Gy组比较，miR－18amimic组SW116细胞中ATM蛋白表达亦减少。见图3。

图1 SW116细胞的剂量生存曲线Fig.1 Dose－survival curves of SW116cells

图3 Western blotting法检测SW116细胞中ATM蛋白表达电泳图Fig.3 Electrophoregram of expressions of ATM protein in SW116cells detected by Western blotting method

3 讨 论

microRNAs是真核生物体内一类内源性的，小的非编码单链RNA，长度22～26个核酸，通过碱基配对与靶mRNA序列3’－UTR结合，引起mRNA降解或转录抑制，从而发挥抑制靶蛋白合成的功能。miRNA在细胞早期发育、增殖和凋亡等多种生物进程中起关键作用。ATM基因定位于人类染色体11q22－23，其表达基因（mRNA）为13000bp，相对分子质量约为350000。众所周知，ATM参与DNA损伤修复，调控端粒代谢活动，阻止细胞凋亡等［10－11］。

李革等［12－13］研究发现：在大肠癌组织和细胞系中均有ATM基因的表达，而且大肠癌细胞株HM7中ATM的高表达与辐射敏感性有关；Kim等［14］研究发现：在结肠癌细胞株 HCT－116中，抑制ATM基因的表达能明显提高HCT－116细胞的辐射敏感性；Williams等［15］对39种包括大肠癌在内的人类癌细胞株进行辐射敏感性实验，发现其中ATM基因突变与大肠癌的辐射敏感性相关，提出ATM基因可作为预测放疗敏感性的分子标志物之一。

本研究结果显示：电离辐射可以降低结直肠癌SW116细胞中miR－18a的表达水平。本研究模拟过表达环境，与阴性对照组（0Gy X射线照射）比较，照射组SW116细胞中D0、Dq和SF2值均降低，放射增敏比为1.30，表明 miR－18amimic对结直肠癌细胞SW116具有明显的放射增敏作用。抑制DNA损伤修复、促进肿瘤细胞凋亡、扰乱细胞周期检查点并使细胞周期再分布等均可增加肿瘤的辐射敏感性［16－19］。本研究随后又构建了稳定表达的GFPLC3细胞模型，用形态学的方法检测了细胞自噬率，结果显示：电离辐射明显地诱导SW116细胞产生自噬，miR－18amimic明显地促进了电离辐射诱导SW116细胞的自噬。

综上所述，miR－18a可增加结直肠癌细胞SW116的辐射敏感性，其机制可能是通过增加辐射诱导的细胞凋亡和自噬实现的，与细胞周期阻滞和细胞周期检查点是否有关还有待于进一步验证。目前，国内外关于miRNA与肿瘤放射敏感性之间关系的研究处于起步阶段，本研究既有重要的科学意义，又有潜在的社会效益。miRNA既有可能成为放疗敏感性相关的新的生物标志物，用于指导临床肿瘤放射治疗，又有可能成为肿瘤治疗的潜在靶点。

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