宁夏回族人群TCF7L2基因rs290487位点多态性与2型糖尿病的关联性分析

杨 易，祁爱琴，郝秀静，徐金瑞

（宁夏大学 西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，宁夏 银川 750021）

我国糖尿病患者人数近1亿，其中2型糖尿病（type 2diabetes mellitus，T2DM）患者约占95%。遗传因素与环境因素共同决定了T2DM的发生［1－2］。T2DM的主要病理生理改变是胰岛素的分泌缺陷和胰岛素抵抗［3］，因此与胰岛素分泌、胰岛素信号传导通路和胰岛β细胞凋亡相关的基因是T2DM发病机制研究的重要候选基因。全基因组关联研究（genome－wide association study，GWAS）显示：转录因子7类似物2（transcription factor 7like 2，TCF7L2）基因异常表达与T2DM 的发生有关联［4－6］。TCF7L2基因又称T细胞转录因子4（T cell factor－4，TCF4），位于人类染色体10q25.3，长度为215.9kb，包括14个外显子。其表达产物是Wnt信号传导通路的关键因子，对胰岛β细胞功能有调控作用。TCF7L2基因发生变异最终导致β细胞功能缺陷，胰岛素分泌不足［7］。TCF7L2基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs） 与T2DM的发生有一定关联性，但对不同种族或人群的研究结果存在差异性［8－10］。rs290487位点位于TCF7L2基因7号内含子上，在10号染色体上位置为114909731。目前在该位点上的研究没有其他位点广泛，且得出的结论亦不一致［11］。目前，尚未见TCF7L2基因rs290487位点多态性与宁夏回族人群T2DM关联性研究的相关报道。本研究采用聚合酶链式反应－限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism，PCR－RFLP）分型方法，对宁夏回族健康个体和T2DM患者TCF7L2基因rs290487位点多态性进行检测，并通过遗传统计分析，旨在揭示该位点多态性与T2DM的关联性，以期为宁夏回族人群T2DM的早期预防提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 所用血样来源于2011年宁夏医科大学附属医院和宁夏回族自治区人民医院住院患者及体检者，其中健康者109名（对照组），T2DM患者111例（T2DM组），年龄30～80岁。个体间均无血缘关系，且3代均为回族，在宁夏回族自治区居住3代以上。根据知情同意的原则，采研究对象的外周静脉血样本用于提取基因组DNA。T2DM纳入标准参照1999年WHO的T2DM诊断标准和1999年10月我国糖尿病学会的中国人群T2DM诊断标准，并排除1型糖尿病、妊娠期糖尿病和其他特殊类型的糖尿病。

1.2 基因组DNA提取 采用常规酚／氯仿提取法提取基因组DNA。

1.3 引物设计 根据GenBank中TCF7L2基因序列设计引物，扩增rs290487位点所在目的片段，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列：F，5′－AGGAGGCTGCCATATTGTTTACTT－3′；R，5′－ACACCTTTCTCATTTTCAATTTCGC－3′，扩增片段长度为153bp。

1.4 PCR反应 反应体系20μL，其中DNA模板（40mg·L－1）1.0μL，上下游引物各0.5μL，2 × Reaction Mix 9.5 μL，Golden DNA Polymerase（2.5U·μL－1）0.5μL，灭菌三蒸水8.0μL。PCR反应条件：94°C预变性5min；94°C变性30s，61℃退火30s，72°C延伸1min，30个循环；72°C延伸10min，4°C保存。扩增完成后，取PCR产物3μL，采用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.5 酶切反应 在20μL酶切体系中，加入PCR产物6μL，10×酶切缓冲液2μL，限制性内切酶（10U·μL－1）0.5μL，灭菌三蒸水 11.5μL。37℃水浴酶切6h后，采用3.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。

1.6 基因型分析 根据酶切产物判断个体基因型，3种基因型对应的酶切产物分别为TT：153bp；CT：153bp、128bp和25bp；CC：128bp和25bp。

1.7 统计学分析 采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。对照组与T2DM组研究对象的基因型和等位基因频数分布分析采用Hardy－Weinberg平衡检验，组间比较采用χ2检验。

2 结 果

2.1 PCR反应结果 扩增出的片段大小与预期大小一致，长度为153bp，且条带清晰，可用于后续酶切反应。见图1。

图1 rs290487位点PCR产物电泳图Fig.1 Electrophoregram of PCR products of rs290487site

2.2 PCR产物酶切反应结果 在对照组和T2DM组中均检出3种基因型，分别为TT、CT和CC。见图2。

图2 rs290487位点PCR产物AccⅡ酶切电泳图Fig.2 Electrophoregram of PCR products of rs290487site digested by AccⅡenzyme

2.3 2组研究对象基因型和等位基因频数分布在对照组和T 2DM组研究对象中基因型频数分布符合 Hardy－Weinberg平衡定律（χ2＝4.021，P＞0.05；χ2＝1.581，P＞0.05），具有群体代表性。见表1。

表1 2组研究对象rs290487位点基因型频数分布的Hardy－Weinberg平衡性检验Tab.1 Hardy－Weinberg equilibrium test for genotypic frequency distribution at rs290487site of TCF7L2gene

T2DM组和对照组研究对象基因型、等位基因频数频数分布：rs290487位点3种基因型TT、CT和CC在对照组研究对象中的频数分别为31.19%、40.37%和28.44%，在T2DM组的频数分别为24.32%、55.86%和19.82%，基因型频数分布组间比较差异无统计学意义（χ2＝5.370，P＞0.05）；等位基因T和C在对照组中的频数分别为51.38%和48.62%，在T2DM组的频数分别为52.25%和47.75%，等位基因型频数分布组间比较差异无统计学意义（χ2＝0.034，P＞0.05）。见表2。

表2 2组研究对象rs290487位点基因型和等位基因频数分布Tab.2 Distribution of genotypic and allelic frequencies at rs290487site of objects in two groups ［n（η／%）］

3 讨 论

SNPs是基因组变异中最常见的一种形式，在人类基因组中大概每1000个碱基中就有1个SNP。不同人之所以对疾病的易感程度有所区别，对药物会产生不同反应，部分受到SNP影响。SNP作为第3代遗传标记，在复杂疾病的基因定位、关联分析、个体疾病易感性分析和药物基因组学的研究中发挥着愈来愈重要的作用。

国内外学者对不同人种TCF7L2基因SNPs位点与T2DM发生的关联性的研究结果表明：T2DM本身具有高度遗传异质性，不同地区和不同种族人群的遗传背景不同，且生活习惯、环境因素等方面也有很大差异。TCF7L2基因变异型增加T2DM的发病风险的原因：在胰岛β细胞中过表达，Wnt信号通路异常，导致前胰岛素加工障碍，胰岛素分泌减少，肠促胰岛素的水平下降，肝糖原输出水平增加，以及胰岛淀粉样蛋白沉积，影响胰岛β细胞功能，并使胰岛凋亡增加。

本研究采用PCR－RFLP法对宁夏回族健康个体和T2DM患者外周血中TCF7L2基因rs290487位点多态性进行检测，结果表明：TCF7L2基因rs290487位点多态性与宁夏回族人群T2DM的发生无关联。目前已有国内学者对不同地区人群TCF7L2基因rs290487位点多态性与T2DM的关联性进行了研究。Chang等［12］对中国台湾汉族人群、Ren等［13］对中国汉族人群、边澈等［14］对中国沈阳地区汉族人群的研究结果均表明：TCF7L2基因rs290487位点多态性与T2DM的发生有关联。而张勇等［1］对中国济南地区人群、纪红梅等［15］对中国辽宁地区人群、邹云莲等［16］对中国昆明地区汉族人群的研究结果均表明：TCF7L2基因rs290487位点多态性与T2DM的发生无关联。任倩等［17］对中国台湾、安徽和黑龙江省3个地区人群的多态性研究进行荟萃分析，合计样本量，使用随机效应模型选取T2DM患者9422例，正常人8585名，结果未发现rs290487位点多态性与T2DM发生有关联。

综上所述，TCF7L2基因与T2DM发生的关联性研究结果在我国呈现出较强的异质性。本研究中TCF7L2基因rs290487位点多态性与宁夏回族人群T2DM发生未表现出关联性，这是否因样本量原因所致，还有待进一步扩大样本量、充实实验指标和实验数据进行验证。

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