肿瘤坏死因子α信号传导通路在儿童哮喘发病机制中的作用

齐 玲，王玮瑶，张艳春，蔡尚霞，杨宁江，刘晓丽

（1.吉林医药学院病理学教研室，吉林 吉林 132013；2.北华大学第二附属医院儿科，吉林 吉林 132021）

近年来哮喘的患病率和死亡率均呈上升趋势，哮喘已成为严重威胁公众健康的一种主要慢性疾病，尤其是儿童哮喘的发生给患儿及家属带来了沉重的负担。研究［1－3］显示：哮喘的发生与肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）有关联，但研究结果仅限于对患者血清TNF－α水平的检测，而半胱氨酸蛋白酶8（cysteine containing aspirate specific protease－8，Caspase－8）、受体相互作用蛋白（reportor interacting protein，RIP）、肿瘤坏死因子相关受体2（TNF receptor－associated factors－2，TRAF－2）和半胱氨酸蛋白酶3（cysteine containing aspirate－specific protease－3，Caspase－3）在儿童哮喘发病中的作用还未见相关报道。因此，本研究检测不同哮喘发作状态时患儿血清中TNF－α通路相关蛋白的表达变化，探讨儿童哮喘的发生机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2011年1月—2012年1月在北华大学第二附属医院住院的33例哮喘患儿，年龄1～14岁，平均年龄（4.8±4.1）岁，其中男性18例，女性15例，患儿诊断均符合2008年中华医学会修订的《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》［4］。选择31名正常门诊体检儿童作为对照组，其中男性14名，女性17名，年龄1～18岁，平均年龄（5.8±2.9）岁。本研究通过北华大学第二附属医院伦理委员会的审核，所有研究对象均已签署或由监护人代为签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器 TNF－α、Caspase－8抗体和二氨基联苯胺（3，3′－diaminobenzidine，DAB）显色试剂（美国 Epitomics公司），TRAF－2和Caspase－3抗体（美国SANTA CRUZ公司），RIP抗体（美国BD公司）；J－26XP超低温高速离心机（美国贝克曼公司），超低温冰箱（MDF－U53V，日本三洋公司），PLUS 384全自动酶标仪（美国MDC公司）。

1.3 ELISA 法检测 研究对象血清中TNF－α、Caspase－8、Caspase－3、TRAF－2和RIP蛋白的表达水平［5］抽取对照组研究对象和哮喘患儿不同时期（急性发作期、临床缓解期及慢性持续期）的外周静脉血2mL，室温静置4h，将上清小心吸至

1.5 mL Eppendorf管中，做好标记后置入4℃冰箱中备用。待收集齐血清样本，设空白对照，每个样本3个复孔。取受试者血清，将血清与包被液按1∶1比例包被后4℃过液。封闭后加入TNF－α、Caspase－8 、TRAF－2、RIP和Caspase－3 抗 体（1∶1000稀释），于 4℃ 过夜。次日加入二抗（1∶1000稀释）室温下孵育2h，加显色液室温避光显色。于自动酶标仪492nm处测定吸光度（A）值，用标准品绘制标准曲线后计算样本浓度。

1.4 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理。各组研究对象血清中 TNF－α、Caspase－8、Caspase－3、TRAF－2和RIP蛋白表达水平以表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

各组研究对象血清中 TNF－α、Caspase－8、Caspase－3、TRAF－2和RIP蛋白表达水平ELISA结果显示：各期哮喘患儿血清中TNF－α表达水平均升高。与对照组比较，哮喘患儿急性发作期血清中 TNF－α、Caspase－3和Caspase－8蛋白表达水平明显升高（P＜0.05），临床缓解期及慢性持续期血清中Caspase－8蛋白表达水平降低，但差异无统计学意义（P＞0.05），临床缓解期血清中Caspase－3蛋白表达水平降低（P＜0.05），而慢性持续期血清中Caspase－3蛋白表达水平升高（P＜0.05）。与对照组比较，哮喘患儿临床缓解期、慢性持续期和急性发作期血清中TRAF2及RIP蛋白表达水平差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

3 讨 论

TNF－α是一种由活化的巨噬细胞所产生的细胞因子，其在炎症反应和细胞免疫等多种病理过程中发挥着关键的作用。因此，有关TNF－α信号传导通路的研究一直是生物医学研究领域的热点内容。TNF－α和TNF－β虽不同，但其DNA序列同源性可达56%，氨基酸水平同源性可达36%，而且两者作用的受体均为肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR）。TNFR 有TNFR1和TNFR2两种形式，均为Ⅰ型跨膜糖蛋白，前者在体内的大多细胞表面均广泛分布，后者仅局限在免疫细胞。当TNF－α与TNFR1结合后，与细胞中TNFR死亡域结合蛋白（TNFR－associated death domain protein，TRADD）结合，再与细胞中Fas相关死亡域蛋白（Fas－associated with death domain protein，FADD）和Caspase－8结合，进而激活其下游Caspase－3蛋白，通过经典的凋亡途径使细胞发生凋亡［6－7］。另一方面，TNF－α与TNFR1相结合后，会募集TRAF2和RIP，进而激活NF－κB信号通路而发挥多重生理调控功能［8－10］。

表1 各组研究对象血清中 TNF－α、Caspase－8、Caspase－3、TRAF－2和RIP蛋白表达水平Tab.1 Expression levels of TNF－α，Caspase－8，Caspase－3，TRAF－2，and RIP proteins in serum of objects in various groups［，ρB／（μg·L－1）］

表1 各组研究对象血清中 TNF－α、Caspase－8、Caspase－3、TRAF－2和RIP蛋白表达水平Tab.1 Expression levels of TNF－α，Caspase－8，Caspase－3，TRAF－2，and RIP proteins in serum of objects in various groups［，ρB／（μg·L－1）］

＊P＜0.05compared with control group.

ase－3 TRAF2 RIP Control 31 14.01±0.51 20.34±0.80 1.23±0.07 4.13±0.21 0.77±0.07 Asthma 33 Clinical remission 15.75±0.96 18.12±1.12 1.03±0.09＊ 2.76±0.08 0.71±0.08 Chronic persistent 17.33±0.51 16.11±1.02 1.36±0.21＊ 4.28±0.42 0.79±0.04 Acute exacerbation 19.86±0.76＊ 32.99±5.04＊ 1.40±0.20＊3.77±0.37 0.77±0.16 Group n TNF－α Caspase－8 Casp

国内外关于哮喘与TNF－α的关系已有大量临床血清学检测结果来支持，但具体TNF－α通路在哮喘发生机制中如何发挥作用尚不清楚［11－13］。本研究结果显示：临床缓解期、慢性持续期和急性发作期哮喘患儿血清中TNF－α表达水平均升高，尤其是急性发作期哮喘患儿血清中TNF－α表达水平明显升高，与对照组比较差异有统计学意义。这说明哮喘儿童血清TNF－α水平与哮喘的发生有密切关联，与此前研究［1－3］结果一致。同时，哮喘患儿处于临床缓解期和慢性持续期时，血清中TNF－α表达水平升高，提示TNF－α可能全程参与了儿童哮喘的发生发展。

急性发作期哮喘患儿血清中Caspase－8蛋白表达水平明显升高，这一结果与TNF－α表达规律一致。说明哮喘急性发作可能通过激活TNF－α通路，活化细胞中的Caspase－8蛋白，使之表达增加，引起凋亡经典途径激活而引发细胞凋亡，促使哮喘发生。Caspase－3是凋亡传导通路的下游凋亡执行蛋白［14－15］，急性发作期患儿血清中 Caspase－3蛋白表达水平亦升高。这进一步验证了哮喘急性发作时TNF－α通路激活，引起细胞中Caspase－8蛋白活化后继而激活Caspase－3蛋白，使细胞凋亡发生，最终诱发哮喘。

本研究结果显示：临床缓解期、慢性持续期和急性发作期哮喘患儿血清中TRAF2和RIP蛋白表达水平与对照组比较差异均无统计学意义。这说明TRAF2和RIP蛋白可能不参与TNF－α信号通路在哮喘中的作用。但由于本实验患儿例数较少，不能完全排除该2种蛋白的作用。具体哪种细胞发生了凋亡，引起患儿哮喘发生尚未完全定论，也可能有其他的凋亡传导通路在哮喘发生中起作用，但哮喘与TNF－α的关系还需更多的动物或细胞实验来证实。

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