p－Tau蛋白在抑郁症大鼠海马组织中的表达

隋竹欣，李 珍，刘 昊，袁 杨，王海涛

（1.河北联合大学基础医学院组织胚胎学系，河北 唐山 063000；2.山东万杰医学院医学系，山东 淄博 255000；河北联合大学附属医院神经内科，河北 唐山 063000）

世界卫生组织调查［1］表明：至2020年，抑郁症将会成为最重要的引起人类残疾的疾病。近年研究［2］显示：抑郁症患者海马部位的神经元存在可塑性变化，海马参与情绪的控制和反应，对情绪反应起非特异性抑制作用，是极其重要的情绪整合区。微管相关蛋白Tau是一种大脑磷酸化蛋白质，在神经系统的发育和维持微管功能方面有重要作用，多种神经系统疾病均出现了与Tau蛋白相关的特征性病理改变，Tau蛋白的过度磷酸化参与了多种神经退行性疾病的发生过程［3］，其在抑郁症发病过程中的作用尚未见详细报道。本研究建立了大鼠抑郁症模型，对大鼠进行行为学检测，尼氏染色观察造模前后大鼠海马神经元形态变化，Western blotting法检测磷酸化Tau（p－Tau）蛋白在不同时间点的表达水平，初步探讨抑郁症发病过程中海马体积异常的原因，为进一步研究抑郁症的发病机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂 健康成年雄性SD大鼠40只，体质量160～180g（河北联合大学实验动物中心提供，动物合格证编号：SCXK京2009－0004），适应性饲养7d后用于实验。饲养条件：22℃～25℃、昼夜节律（12h／12h）、自由饮水进食。p－Tau兔多克隆抗体、β－actin小鼠单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，免疫印迹相关试剂购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 动物分组及模型建立 将40只大鼠随机分为对照组和模型组，每组20只。模型组大鼠给予慢性不可预见性温和刺激（chronic unpredicted mild stress，CUMS）建立模型。刺激包括11种：行为限制24h、鼠笼45℃倾斜24h、潮湿垫料24h、4℃冰水游泳5min、禁食24h、42℃热水游泳5min、禁水24h、双耳电击5s2次（0.8mA）、夹尾1min、鼠笼摇动15min和持续光照24h。以上11种应激随机分配，每天给予大鼠1种应激，同种应激不连续出现，共计2轮。对照组大鼠除每天抓取1次外，不做特殊处理。在应激结束后分别于1、7、14和28d处死大鼠用于实验，对照组大鼠处死时间和模型组相同。

1.3 大鼠行为学检测 ① 糖水偏好实验：禁水禁食24h后，每笼放置2个完全相同水瓶，1%糖水和纯净水各200mL双瓶共饮，测量1h内糖水和普通水消耗量，计算大鼠的糖水偏好率：糖水偏好率＝糖水消耗量／总液体消耗量×100%；② 旷场实验：实验时每次将1只大鼠放入旷场中心方格内，通过动物行为学实验视频分析系统进行测试，测试内容包括行走总路程、中央活动时间、站立次数和修饰行为次数；③ Morris水迷宫实验：连续测试3d，每天6个循环，记录在60s内寻找水平面下平台的时间，即逃避潜伏期。取3d测试成绩计为其空间记忆成绩。

1.4 尼氏染色观察大鼠海马神经元形态 模型组大鼠应激结束后第1天进行取材，将大鼠脑组织冠状切面石蜡包埋，4μm切片，切片脱蜡至水，用尼氏染料浸染20～30min，充分水洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，观察大鼠海马神经元形态学变化。

1.5 Western blotting法检测大鼠海马组织中p－Tau蛋白表达水平 将大鼠直接断头取脑，冰上迅速分离海马，用蛋白裂解液和酶抑制剂提取组织总蛋白。通过BCA定量后按照40μg蛋白量上样进行10聚丙烯酰胺凝胶（SDS－PAGE）电泳，之后进行电转至PVDF膜，5%BSA封闭2h，一抗p－MAP2兔多克隆抗体（1∶1000）4℃冰箱孵育过夜，羊抗兔二抗IgG（1∶5000）室温孵育2h，ECL显色。内参照β－actin用同样方法进行Western blotting分析。以目的条带与内参照的吸光度（A）比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计学分析。2组大鼠糖水偏好实验、旷场试验和Morris水迷宫实验结果以表示，组间比较采用t检验；不同时间点大鼠海马p－Tau蛋白表达水平以表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。

2 结 果

2.1 糖水偏好实验 与对照组比较，模型组大鼠普通水消耗量无明显变化（P＞0.05），糖水消耗量和糖水偏好百分比明显降低（P＜0.01）。见表1。

表1 2组大鼠糖水偏好实验结果Tab.1 Results of sucrose preference test of rats in two group （n＝20，）

表1 2组大鼠糖水偏好实验结果Tab.1 Results of sucrose preference test of rats in two group （n＝20，）

＊P＜0.01 vs control group.

Group Water consumption（V／mL）Sucrose consumption（V／mL）Percentage of sucrose preference（η／%）Control 16.60±2.0742.80±8.2271.20±5.26 Model 18.81±2.3828.00±3.16＊59.00±2.82＊

2.2 旷场实验和水迷宫实验 与对照组比较，模型组大鼠行走总路程、中央活动时间、直立次数和修饰行为次数减少（P＜0.01），平均逃避潜伏期明显延长（P＜0.01）。见表2和图1。

表2 2组大鼠旷场实验和Morris水迷宫实验结果Tab.2 Results of open field test and Morris water maze of rats in two groups （n＝20，）

表2 2组大鼠旷场实验和Morris水迷宫实验结果Tab.2 Results of open field test and Morris water maze of rats in two groups （n＝20，）

＊P＜0.01 vs control group.

Group Overall walking distance（l／m）Central activity time（t／s）Up－right times Grooming behavior Average escape latent period（t／s）Control 62.02±7.66 30.70±6.21 18.40±2.36 12.20±1.68 8.99±1.28 Model 41.62±5.11＊ 16.90±4.17＊ 10.20±2.65＊ 6.00±1.88＊ 21.53±2.58＊

图1 2组大鼠旷场实验和Morris水迷宫实验轨迹图Fig.1 Locus diagram of open field test and Morris water maze of rats in two groups

2.3 大鼠海马细胞形态学 尼氏染色，对照组大鼠海马细胞密度大，锥体细胞层厚，排列亲密整齐，胞体饱满，突起明显。模型组大鼠海马细胞密度小，锥体细胞层变薄，细胞间隙大，排列疏松，细胞核萎缩，突起减少。见图2（插页二）。

2.4 各组大鼠海马组织中p－Tau蛋白表达水平对照组大鼠海马组织中p－Tau蛋白表达水平为（0.50±0.01），模型组大鼠1、7、14和28d海马组织中p－Tau蛋白表达水平分别为0.20±0.01、0.77±0.01、1.20±0.04和0.68±0.04。模型组大鼠CUMS后1d，海马组织中p－Tau蛋白表达水平表达低于对照组（P＜0.01）；7d后开始高于对照组（P＜0.05）；14d明显高于对照组（P＜0.01）；28d仍略高于对照组（P＜0.05）。各组大鼠海马组织中p－Tau蛋白表达见图3。

图3 2组大鼠海马组织中p－Tau蛋白表达电泳图Fig.3 Electrophoregram of expressions of p－Tau protein in hippocampus tissue of rats in two groups

3 讨 论

抑郁症发病率高，发病年龄宽泛，已严重影响人们的身心健康。动物模型的成功建立促进了抑郁症的基础研究。本研究结果表明：应激后大鼠的糖水消耗量和糖水偏好百分比低于对照组，模型组大鼠CUMS后表现出明显的 “快感缺失”症状；旷场实验结果表明：应激后大鼠在新异环境中自主行为、探究行为明显减少；Morris水迷宫实验结果表明：大鼠空间记忆力减退。由此可见CUMS能使大鼠出现愉快感减退，自主探究减少，精神意志运动迟滞等抑郁症状，可以应用于抑郁症的基础研究。这与本课题组前期研究［4］结果一致。

既往研究显示：不论是抑郁症动物模型［5］还是抑郁症患者［6－10］，均表现出海马结构的异常变化。本研究结果提示应激后大鼠海马神经元形态发生改变。海马参与情绪的控制和反应，是极其重要的情绪整合区。近年研究［11－12］显示：抑郁症患者海马部位的神经元存在可塑性变化，海马神经可塑性改变是抑郁症的病理生理学特点之一。Tau蛋白是一种含磷糖蛋白，主要分布在中枢神经系统的神经元轴突和胞浆内，参与维持细胞形态、细胞内物质转运和细胞有丝分裂等过程，其磷酸化程度与神经元的可塑性有关［13］。当Tau蛋白发生高度磷酸化时，可破坏Tau蛋白同微管的结合能力，从而影响细胞骨架系统的稳态［14］。研究［15］表明：在神经退行性疾病中神经细胞凋亡增强与Tau蛋白异常磷酸化有密切的关系。为研究抑郁症发病中海马神经细胞是否存在Tau蛋白磷酸化异常，本实验采用免疫印迹方法检测抑郁症大鼠海马组织中p－Tau表达水平结果显示：大鼠海马组织中p－Tau蛋白表达水平在应激结束后1d显著低于对照组，而7d后高于对照组，14d达到高峰，28d回落但依旧高于对照组，提示应激可以导致Tau蛋白磷酸化增高。p－Tau蛋白影响神经细胞的骨架系统，导致细胞损伤死亡，这可能是导致海马神经元萎缩的原因之一。本课题组前期研究［16］结果证实：抑郁症大鼠海马神经细胞凋亡增加，可能与Tau蛋白磷酸化增高有关。本研究结果显示：应激后1d，大鼠海马p－Tau蛋白表达水平降低，但很快就表现出升高，其详细机制有待深入研究探讨。

综上所述，抑郁症大鼠海马结构异常可能与Tau蛋白磷酸化异常有关，其具体机制在后期的工作中有待于进一步深入研究。

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