苍术提取物对实验性脾虚证大鼠胃肠动力及免疫功能的影响

刘 芬，刘艳菊，田春漫

（1.湖北中医药大学药学院中药化学教研室，湖北 武汉 430065；2.湖北民族学院中医药学院中药学教研室，湖北 恩施 445000）

苍术属菊科植物常用的有茅苍术或北苍术，干燥根茎入药。性温，味甘苦，归肝脾肾三经，主要功能为燥湿健脾，临床常用于治疗食欲不振、腹胀和腹泄等消化系统病症。中医传统理论显示：脾主运化，为后天之本，气血化生之本源。现代研究［1］显示：消化、吸收、代谢、免疫、神经和内分泌等多系统的功能均与脾（胃）有关联。占群体5%～10%的亚健康人群常见消化吸收功能低下、免疫机能障碍，表现为反复腹泻，机体抗病能力低下，而这部分人群多属脾虚。临床研究［2］表明：苍术对脾虚有多种复杂的调理作用，其机制涉及多个方面。现代中药化学、分子生药学研究［3］显示：苍术主要由一系列的倍半萜类成分、聚乙烯炔类成分和糖苷类成分等组成，现已分离和鉴定大约27种成分。目前对苍术的相关药理研究较少，尤其对于其干预脾虚证方面的研究尚属空白，少量的研究主要集中在其挥发油成分方面。现代药理研究［4］表明：苍术挥发油成分具有抗胃溃疡、保肝、抗缺氧和抗心律失常等作用，而关于非挥发性成分方面（如倍半萜苷类）研究很少，国内尚未见报道，但是这些成分在某些药理作用方面可能和挥发油相当甚至超过挥发油。本研究通过建立大鼠脾虚模型，首次从胃肠动力及小肠黏膜免疫功能方面对苍术提取物调理大鼠脾虚证的相关机制进行研究，阐明苍术干预脾虚证的机制，为苍术调控脾虚提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、主要试剂和仪器 雄性健康SD大鼠60只，体质量（200g±20）g，购自同济医科大学实验动物中心，动物许可证号：SKSF（鄂）20130105。制备苍术提取物：取苍术饮片500g（武汉市九州通医药有限公司），先清洗干燥和粉碎，然后用80%乙醇浸泡，12h后再用80% 乙醇热回流提取，共计3次，每2h1次，将3次的提取液合并，通过减压过滤将乙醇回收，制成浓缩的清膏（500g·L－1），使用时按比例配制成混悬液。多潘立酮片（西安杨森制药有限公司，批号130408）；针剂专用活性炭（承德赫达活性炭制造有限公司，批号20130412））；碘 ［I125］胃动素（motilin，MTL）、P物质（substance P，SP）和生长抑素（somatostatin，SS）放射免疫试剂盒（南京诺尔曼生物技术有限公司，批号分别为100363－201306、100257－201303、100493－201301）；生物素化羊抗大鼠IgG、IgA试剂盒（上海宝曼生物科技有限公司，批号分别为20130104、2130205）；抗 Toll样受体4（Toll－like receptor 4，TLR4）免疫组织化学试剂盒（批号20121108）和DAB显色试剂盒（南京建成生物科技有限公司）。GC－1500型γ放射免疫计数器（安徽中科中佳科学仪器有限公司 ）；DG5032型酶联免疫检测仪（南京市华东电子团体医疗装备有限责任公司 ）；UT6062全自动旋转式石蜡切片机（上海莱比信环境技术有限公司）；XSP－300型双目显微镜（上海蔡康光学仪器有限公司）；Image－Pro Plus 5.1分析系统、Motic图像分析系统（奥林巴斯中国有限公司）

1.2 大鼠脾虚模型的制备 大鼠脾虚模型的建立参照曾益宏等［5］创立的破气苦降加饥饱失常法。每日给大鼠灌服小承气汤煎剂（大黄、厚朴和枳实按4∶5∶3的比例组方）1次，按生药60g·kg－1给药，将小承气汤煎剂质量浓度配成6g·mL－1，大鼠给药灌胃量为10mL·kg－1，隔日进食1次，每次喂饲常规量的半量，自由饮水，造模同时记录大鼠体质量、进食量并观察临床表现及大便情况。

1.3 动物分组和给药 大鼠随机分成正常组，模型组，低、中、高剂量苍术提取物（5.0、10.0、20.0g·kg－1）组，多潘立酮（5.0mg·kg－1）组，每组10只，除正常组外，其余各组大鼠均按破气苦降加饥饱失常法进行造模，造模时间为15d，造模结束后次日开始灌胃给药，各组大鼠每天灌胃量为2mL，正常组和模型组大鼠则给予2mL生理盐水，每日1次，连续用药10d。

1.4 ELISA法检测大鼠肠道灌流液中IgA和血清中IgG的水平 最后一次灌胃给药后，所有大鼠禁食不禁水24h，然后灌胃大鼠肠灌洗液4次，每次2mL，每次间隔15min，按文献 ［5］方法收集肠灌洗液，第4次灌胃后，立即将0.1mg毛果芸香碱注射到大鼠皮下，并将大鼠放在铁质筛网上，用含有2mL EDTA的平皿收集大鼠的肠道排泄物，最后冲净大鼠残留在筛网上的排泄物并将其回收。然后将排泄物置于离心机中3000g离心10min，收集上清加入12%叠氮钠与苯甲基磺酸氟（100mmol·L－1）各50μL，低温静置15min，再加入7%牛血清白蛋白250μL，－20℃保存，采用ELISA双抗体夹心法测定肠液中的分泌型IgA表达水平，在酶标包被板上设标准品孔10孔，稀释后各孔加样量均为50μL，标准品的稀释与加样、温育、配液、洗涤、加酶、温育、洗涤和显色、终止，以测定450nm波长处各孔的吸光度（A）值，测定在加终止液15min以内进行。根据标准品的浓度及对应的A值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的A值通过回归方程计算出对应的样品浓度。大鼠血清中IgG水平的ELISA检测方法同IgA的检测方法。

1.5 炭末灌胃法检测大鼠小肠推进比和胃内残留率 用含5%炭末和2%CMC－Na的炭末混悬液2.5mL灌胃大鼠，30min后每只大鼠用1%戊巴比妥钠1.2mL麻醉，腹主动脉采血法采血6mL，用颈椎脱臼法处死大鼠，剖开腹腔，将幽门至回盲部的肠管一段取出并测量其长度，此即小肠的总长度，然后测出炭末推进长度，即幽门部到炭末前沿的长度，计算出小肠推进率，其公式为：小肠推进率 ＝ 幽门部到炭末前沿的长度／小肠的总长度×100%；然后将大鼠的胃贲门和幽门部两端分别结扎并称取胃的质量，将胃体沿胃大弯剪开，将胃内残留物洗净，滤纸拭干称质量，即胃净质量，用胃全质量减去胃净质量即得胃内残留物的质量，胃内残留率＝（胃全质量－胃净质量）／炭末混悬液灌胃总质量×100%。

1.6 放射免疫法检测大鼠血浆中 MTL、SP和SS水平 采用放射免疫法检测血浆中 MTL、SP和SS水平，上述检测步骤均严格按试剂盒说明书操作。放射免疫检测采用γ－免疫计数器，根据γ－免疫计数器预先编制程序，直接给出有关参数、标准曲线及样品检测的浓度。

1.7 免疫组织化学法检测大鼠各肠段（十二指肠、空肠和回肠）组织中TLR4表达水平 切取长宽均为5mm的各肠段（十二指肠、空肠和回肠）的肠黏膜1块，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，采用免疫组织化学法进行检测。所有切片均在高倍显微镜下（同一条件）观察，阳性细胞的判定标准是细胞质或胞核被染为棕黄色或棕褐色。每个样本随机检测染色较好的5个高倍视野，采用Image－Pro Plus 5.1分析系统半定量分析，观察并计算绒毛顶端内和肠道横断面固有层单位面积上TLR4阳性细胞染色的积分吸光度（IA）值，5个高倍视野中IA值的均数即为该样本阳性细胞的IA值。

1.8 统计学分析 采用SPSS l7.0统计软件对数据进行统计学分析。大鼠血浆中MTL、SP和SS水平以表示，组间比较采用t检验；大鼠肠道灌流液中Ig A和血清中IgG水平、小肠推进比、胃内残留率和大鼠各肠段（十二指肠、空肠和回肠）组织中TLR4蛋白表达水平以表示，组间比较采用方差分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠肠道灌流液中IgA及血清中IgG水平 与正常组比较，模型组大鼠肠道灌流液中IgA及血清中IgG水平降低（P＜0.01）；与模型组比较，低、中、高剂量苍术提取物组和多潘立酮组大鼠肠道灌流液中Ig A及血清中IgG水平均升高（P＜0.05或P＜0.01）；与多潘立酮组比较，中和高剂量苍术提取物组大鼠肠道灌流液中Ig A及血清中IgG水平升高（P＜0.05或P＜0.01）；与低剂量苍术提取物组比较，中和高剂量苍术提取物组大鼠肠道灌流液中Ig A及血清中IgG水平升高（P＜0.05或P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠肠道灌流液中Ig A和血清中IgG水平Tab.1 Levels of IgA in intestinal perfusion fluid and IgG in serum of rats in various groups［n＝10，，ρB／（g·L－1）］

表1 各组大鼠肠道灌流液中Ig A和血清中IgG水平Tab.1 Levels of IgA in intestinal perfusion fluid and IgG in serum of rats in various groups［n＝10，，ρB／（g·L－1）］

＊P＜0.01 vs normal group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs model group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs domperidone group；▲P＜0.05，▲▲P＜0.0lvs low dose of Rhizoma atractylodis extract group.

Group IgA IgG 1.05±0.08 5.69±0.86 Model 0.29±0.02＊ 2.02±0.15＊Domperidone 0.40±0.03△ 3.01±0.28△Rhizoma atractylodis extract Low dose 0.44±0.03△3.11±0.26△Medium dose 0.65±0.05△△#▲ 4.15±0.29△△#▲High dose 0.99±0.08△△##▲▲ 5.67±0.78△△##▲▲Normal

2.2 各组大鼠胃内残留率和小肠推进比 与正常组比较，模型组大鼠胃内残留率明显升高（P＜0.01），小肠推进比明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，低、中、高剂量苍术提取物组和多潘立酮组大鼠胃内残留率明显下降、小肠推进比明显升高（P＜0.05或P＜0.01）；与多潘立酮组比较，高剂量苍术提取物组大鼠胃内残留率进一步下降，但两者比较差异无统计学意义（P＞0.05），而小肠推进比则升高（P＜0.05）；与低剂量苍术提取物组比较，中和高剂量苍术提取物组大鼠胃内残留率明显下降、小肠推进比明显升高（P＜0.05或P＜0.01）。见表2。

2.3 各组大鼠血浆中MTL、SP和SS水平 与正常组比较，模型组大鼠血浆中MTL、SP和SS水平降低（P＜0.01）；与模型组比较，低、中、高剂量苍术提取物组和多潘立酮组大鼠血浆中MTL、SP和SS水平升高（P＜0.05或P＜0.01）；与多潘立酮组比较，中和高剂量苍术提取物组大鼠血浆中MTL、SP和SS水平升高（P＜0.05或P＜0.01）；与低剂量苍术提取物组比较，中和高剂量苍术提取物组大鼠血浆中MTL、SP和SS水平升高（P＜0.05或P＜0.01）。见表3。

表2 各组大鼠胃内残留率和小肠推进比Tab.2 Rates of stomach retention and ratios of small intestinal propulsion of rats in various groups（n＝10，，η／%）

表2 各组大鼠胃内残留率和小肠推进比Tab.2 Rates of stomach retention and ratios of small intestinal propulsion of rats in various groups（n＝10，，η／%）

＊P＜0.01 vs normal group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs model group；#P＜0.05 vs domperidone group；▲P＜0.05，▲▲P＜0.0l vs low dose of Rhizoma atractylodis extract group.

Group Rate of stomach retention Ratio of small intestinal propulsion Normal 26.2±3.6 74.4±6.8 Model 69.9±8.3＊ 29.8±4.4＊Domperidone 29.1±3.5△△ 62.4±5.7△△Rhizoma atractylodis extract Low dose 52.4±5.4△ 40.2±7.2△Medium dose 39.5±4.4△△▲ 53.8±6.1△△▲High dose 28.1±3.1△△▲▲ 72.7±5.1△△#▲▲

2.4 各组大鼠各肠段（十二指肠、空肠和回肠）组织中TLR4表达水平 TLR4阳性物质呈棕黄色，主要分布于黏膜下层和小肠绒毛顶端。各组大鼠十二指肠、空肠和回肠的黏膜下层及绒毛顶端TLR4的表达水平：正常组分别为13.5±1.3、9.8±0.7、19.1±1.9，模型组分别为4.3±0.4、3.1±0.2、7.7±0.6、低剂量苍术提取物组分别为6.9±0.6、5.1±0.4、11.6±1.0，中剂量苍术提取物组分别为9.3±0.8、7.0±0.6、14.9±1.3，高剂量苍术提取物组分别为13.2±1.1、9.6±0.6、18.9±1.7，多潘立酮组分别为6.1±0.6、5.3±0.5、10.2±1.0。与正常组比较，模型组大鼠十二脂肠空肠和回肠组织中TLR4表达水平降低（P＜0.01）；与模型组比较，低、中、高剂量苍术提取物组和多潘立酮组大鼠十二指肠、空肠和回肠的黏膜下层和绒毛顶端的TLR4表达水平升高（P＜0.05或P＜0.01）；与多潘立酮组比较，中和高剂量苍术提取物组大鼠十二指肠、空肠和回肠的黏膜下层和绒毛顶端的TLR4的表达水平升高（P＜0.05或P＜0.01）；与低剂量苍术提取物组比较，中和高剂量苍术提取物组大鼠十二指肠、空肠和回肠的黏膜下层和绒毛顶端的TLR4的表达水平升高（P＜0.05或P＜0.01）。各组大鼠十二指肠组织中TLR4的表达见图1（插页二）。

表3 各组大鼠血浆中MTL、SP和SS水平Tab.3 Levels of MTL，SP，and SS in plasma of rats in various groups［n＝10，，ρB／（ng·L－1）］

表3 各组大鼠血浆中MTL、SP和SS水平Tab.3 Levels of MTL，SP，and SS in plasma of rats in various groups［n＝10，，ρB／（ng·L－1）］

＊P＜0.01 vs normal group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs model group；#P＜0.05 vs domperidone group；▲P＜0.05，▲▲P＜0.0lvs low dose of Rhizoma atractylodis extract group.

Group MTL SP SS Normal 90.19±9.12 9.39±1.55 70.34±9.12 Model 40.28±5.21＊ 4.21±1.26＊ 39.45±9.01＊Domperidone 71.15±8.25△△ 7.01±1.11△△ 58.15±6.18△△Rhizoma atractylodis extract Low dose 55.14±3.68△5.69±1.37△50.15±4.63△Medium dose 70.25±3.71△△▲ 7.28±1.45△△▲ 60.12±5.01△△▲High dose 88.54±7.34△△#▲▲ 9.01±1.05△△#▲▲ 69.13±8.45△△#▲▲

3 讨 论

脾虚证以运动、消化吸收功能障碍作为主要表现，是一种多器官多系统功能障碍的综合性症候群。有研究［6］显示：绝大部分的消化系统疾病以及免疫功能低下性疾病都存在脾虚证的证候，运用补脾运脾法多能奏效。脾胃功能与胃肠运动关系密切［7］。目前，脾虚证模型的造模方法较多，如情志失和法、苦寒泻下法、过度疲倦法和饮食失节法［8］等。而在大黄苦寒泻下基础上改进的破气苦降加饥饱失常法是目前运用较普遍的一种造模方法，有研究［9］报道该种造模方法所造成的脾虚证模型症状与临床所见的脾虚证表现非常相似。本研究亦利用此法，用含有大黄药味的小承气汤耗伤大鼠脾胃元气以致脾虚。

有研究［10］表明：脾虚证与胃肠炎症、胃肠道的神经肌肉调控系统、胃肠激素分泌和胃肠免疫调节功能障碍等多种病理生理改变均有关系，其主要临床表现为胃排空延迟和小肠传输功能障碍以及胃肠免疫系统功能严重受损。本研究即选取胃排空率和小肠推进比观察苍术对脾虚大鼠胃肠功能的影响，实验中观察到脾虚模型大鼠胃排空及小肠推进率降低明显。MTL是一种很重要的胃肠激素，具有促进胃肠运动的作用。SP具有兴奋胃肠运动的功能，对几乎所有的消化道平滑肌都具有刺激其收缩的作用［11］。SS可通过抑制胃肠道激素和乙酰胆碱而起到间接调整胃肠道运动的作用［12］，三者均能很好地体现胃肠功能的变化。脾虚可使上述胃肠激素表达明显异常，而使用苍术提取物干预以后，脾虚证大鼠无论是胃肠动力障碍还是相关胃肠激素的表达均明显改善，提示苍术至少可从胃肠道－神经肌肉调控系统及胃肠激素两个方面来调节胃肠功能，改善脾虚证的临床症状，从而有利于胃肠疾病的康复。

有研究［13］表明：脾虚状态下，胃肠黏膜极易发生损害，这可能与脾虚证导致机体全身和局部胃肠黏膜免疫功能低下有关，而脾虚证的好转既体现在胃肠功能的好转，同时也包括胃肠组织结构、激素表达和免疫功能等方面整体好转，而且上述各个方面也相互联系和相互影响，彼此不是孤立的。因此，本研究探讨苍术提取物对实验性脾虚大鼠胃肠功能的影响外，同时还探讨了苍术提取物对脾虚大鼠模型免疫功能的影响情况。中医理论认为：脾为后天之本，气血生化之源，气之充盈与否与脾的功能息息相关，而气主防御的功能与现代医学中的免疫系统的功能极为相似，与胃肠道黏膜的免疫功能存在着某种内在联系。研究［14］表明：免疫调节机制的紊乱即与脾虚泄泻的发生关系密切，小肠免疫在整个消化系统的免疫作用中占有很重要的地位。lgG和IgA是胃肠黏膜执行免疫功能的重要分子。临床研究［15］表明：外科脾虚患者免疫功能常处于低下状态，表现在血清中IgA、IgG水平显著低于正常水平；本研究选取了血清IgG及肠道灌流液中Ig A水平的变化阐明苍术提取物对胃肠黏膜免疫功能的影响的深层次机制。本研究观察到各剂量苍术提取物组大鼠血清中IgG和肠道灌流液中IgA水平高于脾虚证大鼠，说明大鼠处于脾虚证时其体液免疫受到严重抑制，而苍术提取物对胃肠局部黏膜和机体整体的体液免疫能力均有提高。TLRs是表达于肠道黏膜上皮细胞的一种多肽分子，研究［16］表明：其与肠道黏膜天然免疫功能关系非常密切，其中有代表性的是TLR4，其在天然免疫应答中扮演了非常重要的角色，在天然免疫和获得性免疫之间起到了桥梁作用。因此，在更深层次上，本研究对脾虚大鼠肠道TLR4的表达变化进行的检测结果显示：脾虚可使大鼠小肠黏膜中TLR4的表达水平明显降低，从而导致脾虚大鼠肠道局部天然免疫功能被抑制，致使其抗御病原侵袭的能力降低，并有可能进一步导致小肠组织结构损伤。同时本研究结果亦表明：苍术提取物可提高脾虚大鼠肠道黏膜细胞TLR4的表达，从而提高肠道的局部天然免疫能力，进而有利于脾虚所导致的胃肠道组织结构的损伤及功能紊乱的改善。

［1］易受乡，彭 艳，彭 芬，等.艾灸对脾虚大鼠小肠上皮线粒体超微结构及呼吸链酶含量的影响 ［J］.世界华人消化杂志，2011，19（29）：3028－3034.

［2］王丹凤，刘玉强，才 谦.苍术麸炒前后健脾作用研究 ［J］.时珍国医国药，2013，24（1）：155－156.

［3］付梅红，朱东海，方 婧，等.苍术的化学、分子生药学和药理学研究进展 ［J］.中国中药杂志，2009，34（20）：2669－2672.

［4］王文凯，张 正，翁 萍，等.近年苍术炮制研究进展 ［J］.时珍国医国药，2014，25（1）：195－197.

［5］曾益宏，刘友章，徐 升.益气健脾法对脾虚证大鼠红细胞膜ATPase活性的影响 ［J］.四川中医，2011，29（2）：24－25.

［6］彭 艳，彭 芬，易受乡，等.艾灸对脾虚大鼠小肠运动吸收功能及ATP含量的影响 ［J］.中国针灸，2012，32（3）：246－250.

［7］杨泽民，陈蔚文，王颖芳，等.慢性浅表性胃炎脾虚证患者与健康人物质能量代谢基因差异表达研究 ［J］.中国中西医结合杂志，2013，33（2）：159－163.

［8］米 红，李燕舞，王晓燕，等.黄芪总苷对脾虚大鼠胃黏膜保护机制探讨 ［J］.中药药理与临床，2012，28（5）：61－63.

［9］廖乐乐，罗翱翔，唐干益，等.四君子汤对大黄脾虚模型小鼠的影响 ［J］.广东药学院学报，2013，29（2）：202－205.

［10］刘未艾，郁保生，常小荣，等.隔药饼灸对功能性胃肠病肝郁脾虚模型大鼠胃肠激素及胃肠动力的影响 ［J］.世界华人消化杂志 ，2013，21（11）：1002－1007.

［11］刘未艾，何亚敏，刘 密，等.隔药饼灸对功能性胃肠病肝郁脾虚模型大鼠 MTL、GAS、VIP的影响 ［J］.实用中医内科杂志，2013，27（1）：83－90.

［12］张吉仲，李利民，黄 利，等.半夏泻心汤及其拆方对脾虚大鼠胃泌素和生长抑素的影响 ［J］.中药药理与临床，2013，29（1）：15－17.

［13］李 聪，谢 鸣，赵荣华.柴疏四君汤对肝郁－脾虚－肝郁脾虚不同证候模型大鼠消化系统功能的影响 ［J］.中华中医药杂志，2014，2（1）：72－75.

［14］熊 斌，钱会南.中医脾虚证与免疫功能关系研究进展 ［J］.湖北中医杂志，2013，35（6）：76－78.

［15］赵荣华，谢 鸣，李 聪，等.肝郁、脾虚和肝郁脾虚证模型大鼠的免疫功能变化 ［J］.北京中医药大学学报，2013，36（12）：821－824.

［16］杨钦河，黄 进，张玉佩，等.疏肝健脾方药对 NASH大鼠肝组织TLR4mRNA及其蛋白表达的影响 ［J］.中药材，2013，36（1）：78－84.