硫化氢对糖尿病大鼠心肌组织中MT1－MMP和TIMP－2蛋白表达及心肌纤维化的影响及其机制

褚 春，曾 欧，罗 健，李 芳，肖 婷，周松柏，杨 军

（1.南华大学附属第二医院药剂科，湖南 衡阳421001，2.南华大学附属第一医院心血管内科，湖南 衡阳 421001）

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DC）作为糖尿病（diabetes melltus，DM）一种独立心血管并发症，目前日益受到重视，但其发病机制十分复杂，至今仍未完全阐明。有研究［1］显示：DC的发生发展与心肌纤维化有密切关联。目前研究［2］显示：DM心肌纤维化的发生机制与基质金属蛋白酶（MMPs）／基质金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitors of matrix metalloproteinases，TIMPs）的调控紊乱有关联，但其中内在机制目前尚不清楚。膜型基质金属蛋白酶1（membranetype 1matrixmetallo－proteinase，MT1－MMP）是基质金属蛋白酶家族的新成员，可降解各种细胞间质大分子，活化proMMP－2和MMP－13促进细胞迁移等［3－6］。MT1－MMP作为一种细胞周围微环境的调节因子，可修饰细胞外环境，导致细胞间质或黏附分子信号转导的改变，故在肿瘤转移、器官纤维化和结构重构中起重要作用［8－10］。MT1－MMP在心肌纤维化过程中起重要作用，但MT1－MMP在DM心肌纤维化中的作用目前尚未见报道。硫化氢（H2S）作为一种新发现的气体信号分子，已有研究［7］显示：其在心血管系统具有多种生物学效应和心脏保护作用。而H2S是否参与糖尿病心肌纤维化以及信号调控机制，目前尚不清楚。TIMP是MMPs内源性特异性抑制因子，与MMPs激活和活性的调节有关。有研究［11］显示：H2S参与MMPs／TIMPs的调控，但对DM大鼠心肌组织中MT1－MMP／TIMP－2的调控尚未见报道。本实验建立DM大鼠模型，观察气体信号分子H2S对DM大鼠心肌纤维化以及MT1－MMP蛋白表达和MT1－MMP／TIMP－2失调的影响，探讨H2S 在DM心肌纤维化发生发展中的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂 成年清洁级雄性SD大鼠52只，体质量（280±40）g，购自南华大学动物实验中心，动物合格证号：SYXK（湘）2010－0006，分笼饲养于清洁级实验室恒温（23±1℃）环境中，人工照明，白天黑夜各12h，所有大鼠均可自由获得水和食物。兔源 MT1－MMP、TIMP－2一抗、兔源Ⅲ型胶原蛋白和GAPDH一抗购于中国博士德公司；硫氢化钠（NaHS）购于美国Sigma公司；抗兔二抗购于美国Proteintech公司；BCA蛋白定量试剂盒、细胞裂解液购于中国碧云天公司。

1.2 实验分组及DM模型建立 52只SD大鼠饲养1周后随机分为对照组、DM组、H2S干预糖尿病组（DM＋H2S组）和H2S干预组（H2S组），每组13只。DM＋H2S组与DM组大鼠按体质量腹腔注射链脲佐菌素（STZ）40mol·kg－1；注射后24h内给予5%葡萄糖水防止大鼠发生低血糖休克；注射72h后，尾静脉采血测血糖水平，血糖水平大于16.7mmol·L－1提示造模成功。大鼠在造模后至处死前均有死亡，且集中在造模后2周内，各组死亡数量不等，共死亡大鼠12只，至8周末各组大鼠总生存率为77%（40／52）。造模结束后，对照组、DM组、DM＋H2S组和H2S组剩余实验大鼠分别为12、9、9和10只。对照组大鼠精神状反应敏捷，毛色白而光泽。DM大鼠出现不同程度的多食、多尿、多饮和消瘦等症状，反应迟钝，皮毛无光泽。造模成功后，H2S组和DM＋H2S组大鼠每天腹腔注射NaHS溶液（100μmol·kg－1）；而对照组和DM组大鼠每天腹腔注射等量的生理盐水，持续8周。

1.3 van Gieson（VG）染色观察大鼠心肌组织病理学形态 将大鼠断颈处死，取4组大鼠左心室心肌组织，于常规10%甲醛溶液中固定，经逐级脱水、浸蜡、包埋、切片，行VG染色，100倍光镜下观察大鼠心肌结构及纤维化程度。

1.4 Western blotting法检测各组大鼠心肌组织中Ⅲ型胶原蛋白、MT1－MMP和TIMP－2蛋白的表达水平 取4组大鼠新鲜左心室心肌组织，提取蛋白后采用BCA比色法进行定量。蛋白经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳后，湿转法将转至PVDF膜。5%BSA封闭2h后，以Ⅲ型胶原和GAPDH一抗（稀释度均为1∶400）37℃孵育1h后4℃过夜，用TBST洗膜，以HRP标记的二抗（稀释度为1∶4000）37℃孵育1h，再次洗膜后以ECL显色，曝光扫描后以图像分析软件进行光密度分析。以目的条带与GAPDH的灰度比值分别表示Ⅲ型胶原蛋白表达水平。取4组大鼠心肌组织，以MT1－MMP、TIMP－2和GAPDH一抗（稀释度均为1∶400），37℃孵育1h或4℃过夜，TBST洗膜；以HRP标记的二抗（稀释度为1∶2000）37℃孵育1h，洗涤和显影后行灰度扫描，GAPDH作为内参，以目的条带与GAPDH的灰度比值分别表示 MT1－MMP和TIMP－2的蛋白表达水平。

1.5 统计学分析 采用SPSS 11.0统计软件进行统计学分析。各组大鼠心肌组织中Ⅲ型胶原、MT1－MMP和TIMP－2蛋白表达水平以表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌组织病理形态学 光镜下观察VG染色的心肌组织切片，胶原纤维呈红色。对照组大鼠心肌细胞排列紧密整齐，心肌组织血管周围及肌间隙中仅有少量胶原沉积；H2S组与对照组大鼠镜下表现类似。DM组大鼠心肌细胞排列疏散紊乱，心肌组织血管周围胶原沉积较对照组增多，且向周围间质延伸，间质可见少量炎细胞浸润；DM＋H2S组大鼠心肌壁内血管周围胶原沉积较DM组明显减少。见图1（插页二）。

2.2 各组大鼠心肌组织中Ⅲ型胶原纤维蛋白的表达水平 与对照组（0.9644±0.0176）比较，DM组大鼠心肌组织中Ⅲ型胶原蛋白表达水平（1.1875±0.0407）明显升高（P＜0.05）； 而DM＋H2S组大鼠心肌组织中的Ⅲ型胶原蛋白的表达水平（0.9999±0.0152）低于 DM组（P＜0.05）。与对照组比较，H2S组大鼠心肌组织中Ⅲ胶原蛋白表达水平（0.9644±0.1777）无明显变化（P＞0.05）。各组大鼠心肌组织中Ⅲ型胶原蛋白表达电泳图见图2。

图2 各组大鼠心肌组织中Ⅲ型胶原蛋白表达电泳图Fig.2 Electrophoregram of expressions of typeⅢ collagen protein in myocardium tissue of rats in various groups

2.3 各组大鼠心肌组织中 MT1－MMP和TIMP－2蛋白的表达水平 与对照组比较，STZ组大鼠心肌组织中 MT1－MMP和TIMP－2蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；与STZ组比较，STZ＋H2S组大鼠心肌组织中 MT1－MMP和TIMP－2蛋白表达水平明显下降（P＜0.05）。H2S组和对照组大鼠心肌组织中 MT1－MMP和TIMP－2蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3和表1。

图3 各组大鼠心肌组织中 MT1－MMP（A）和TIMP－2（B）蛋白表达电泳图Fig.3 Electrophoregram of expressions of MT1－MMP（A）and TIMP－2（B）proteins in myocardium tissue of rats in various groups

3 讨 论

在诸多DM慢性并发症中，DC具有极大的危害性，而其发生发展的机制与心肌纤维化有关联［1－2，12］。心肌纤维化不仅是 DC 心肌重构的主要标志，也是导致左心功能障碍的主要原因。DM心肌纤维化的发病机制尚不十分清楚，但有研究［1－2，13］显示其发生发展与MMPs／TIMPs的失调有关。MMPs是一大类结构上具有很大同源性的锌依赖性内肽酶家族，能有效降解细胞间质蛋白质。MT1－MMP是一种表达在细胞膜上的特殊类型的MMP，属于膜型MMPs，其可作用于多种细胞外基质成分和细胞黏附分子，参与许多重要的生理和病理过程，尤其是组织重构［3］。MT1－MMP的底物有细胞间质的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原和蛋白多糖、层黏蛋白及纤维连结蛋白等，除直接降解细胞间质成分外，MT1－MMP在羧基末端还有一跨膜结构域，可启动细胞表面多个蛋白级联反应，因此MT－MMPs的表达增加可触发瀑布式的MMPs，如MMP－9和MMP－2等激活过程，并进一步促使细胞间质蛋白的降解。有研究［4－5］显示：在 MMPs由酶原向活性形式转化的过程中，MT1－MMP起重要的激活作用，故MT1－MMP可通过直接和间接作用参与细胞外基质的降解与改建，在肿瘤迁移和纤维化发生发展过程中起重要作用。本研究结果显示：正常大鼠心肌组织中，MT1－MMP蛋白有一定表达，但在DM大鼠心肌组织中，MT1－MMP蛋白表达水平则明显上升，与此同时心肌组织存在明显间质纤维化，Ⅲ型胶原蛋白的表达水平也明显升高，提示MT1－MMP表达水平的上调可能参与了DM心肌纤维化的发生。

表1 各组大鼠心肌组织中 MT1－MMP和TIMP－2蛋白表达水平Tab.1 Expression levels of MT1－MMP and TIMP－2 proteins in myocardium tissue of rats in various groups（）

表1 各组大鼠心肌组织中 MT1－MMP和TIMP－2蛋白表达水平Tab.1 Expression levels of MT1－MMP and TIMP－2 proteins in myocardium tissue of rats in various groups（）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs DM group.

Group n MT1－MM2 TIMP－2 Control 121.0178±0.00890.9555±0.0086 DM 91.3489±0.0265＊1.3050±0.0084＊DM＋H2S 91.1671±0.0168△0.8035±0.1324△H2S 101.0414±0.01010.8166±0.0127

当TIMP－2的分子数目远远超过 MMPs时，可与活化的MMPs以1∶1比例结合，并抑制其活性，故两者的平衡对维持正常的胶原代谢具有重要意义，也决定着细胞间基质的降解和重建［13－14］。TIMPs家族中TIMP－2对MMPs的抑制作用最强，当MMPs被激活的同时，TIMP通常也被激活，已有研究［15］显示：DM 大鼠心肌纤维化过程中TIMP－2表达水平明显升高。本研究结果显示：DM大鼠心肌组织中TIMP－2表达水平升高，这可能与MMPs的激活以及细胞间质降解产物的刺激有关。MT1－MMP／TIMPs的表达水平正常应处于动态平衡状态，从而调控细胞外间质和胶原蛋白的降解和产生。一旦平衡被破坏，MT1－MMP活性增强可引起胶原降解和变性，从而导致心肌间质纤维化。H2S作为新发现的内源性气体信号分子，参与多种生物学效应及心血管调节作用，尤其是心肌重构［6］。本研究结果显示：H2S干预后DM大鼠心肌纤维化明显改善，Ⅲ型胶原表达也明显下调，提示H2S的干预可改善DM大鼠的心肌间质纤维化；与DM组比较，DM＋H2S组大鼠心肌组织中 MT1－MMP蛋白的表达水平明显下调，TIMP－2蛋白的表达水平亦下调，提示H2S可能通过下调 MT1－MMP和TIMP－2表达水平以及纠正MT1－MMP／TIMP－2表达失衡，进而减轻 DM 大鼠的心肌纤维化。目前国内外尚无关于H2S下调DM大鼠心肌组织中 MT1－MMP和TIMP－2蛋白表达水平的报道，但已有学者［11，16］发现：H2S可下调肝癌细胞和前列腺癌细胞中MMP－9和MMP－2蛋白的表达水平，并抑制肿瘤细胞的迁移。MT1－MMP通过降解细胞间质以及激活其他MMPs参与纤维化进程，并与心肌纤维化发生发展有关［17－20］。H2S改善DM 心肌纤维化的机制可能与下调MT1－MMP表达以及维持MT1－MMP／TIMPs平衡有关，但其中的具体信号机制和应用前景仍有待深入研究。

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