JNK信号转导通路在黄芩苷诱导肝癌细胞凋亡中的作用

周 曙，蔡 涛，覃兴贵，赵蕾蕾，薛 李

原发性肝癌位于全球癌症致死的第4位，中国恶性肿瘤致死的第3位［1］。除手术根治性切除外，常规的治疗即为术前或术后的辅助放化疗。由于本病早期无明显症状，故而诊断困难，导致病情延误，过半患者在确诊时已经丧失了手术根治的可能性。而化疗药普遍存在着毒性反应大和耐药性等问题，并不能很好改善患者的生存时间和生存质量［2］。与常规化疗药相比，传统医药以其独特的药理成分在抗癌、防癌的治疗过程中占据优势［3］。黄芩苷作为传统中药黄芩的提取物，是一种黄酮类化合物，具有抗炎、解热、保肝的作用［4］。研究发现黄芩苷能够抑制多种肿瘤细胞的凋亡，但是其具体机制尚未明确［5］。细胞内最常见的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信号通路能够控制细胞的增殖、分化和凋亡。而c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-teminal Kinase，JNK)作为MAPK家族中的一员，被认为在细胞凋亡中起到重要作用［6］。不仅如此，研究发现多种药物通过调控JNK信号通路来诱导肿瘤细胞凋亡，对于黄芩苷是否能够通过JNK信号通路抑制肝癌细胞尚不明确。因此，本研究旨在初步探讨黄芩苷抑制肝癌细胞凋亡的作用机制，通过体外实验研究黄芩苷是否通过激活JNK信号通路诱导肝癌细胞的凋亡，从而达到其抗肿瘤的功效，进而明确黄芩苷在肝癌治疗中的临床价值。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器 细胞:人肝癌HepG2细胞系(中国典型培养物保藏中心);试剂:黄芩苷(南京青泽医药有限公司)、SP600125(美国Sigma公司)、小牛血清(郑州益康生物公司)、DMEM培养基(美国Hyclone公司)、二甲基亚砜(DMSO，美国 Sigma公司)、MTT细胞增殖与细胞毒检测试剂盒(北京赛驰生物公司)、BCA蛋白定量试剂盒(美国Thermo公司)、兔抗 JNK及 p-JNK一抗(美国 Cell signal公司)、山羊抗兔二抗(美国Santa Cruz公司)。仪器:倒置显微镜(日本 Olympus公司)、酶标仪(美国BIO-Rad公司)、细胞培养箱(美国Thermo公司)、凝胶图像分析系统(上海天能公司)。

1.2 方法

1.2.1 HepG2细胞培养:细胞从液氮复苏后置于含10%小牛血清的DMEM培养基，5%CO2、37℃培养箱培养，每2～3 d取对数生长期细胞传代1次。

1.2.2 MTT细胞增殖和细胞毒性实验:将处于生长对数期的HepG2细胞用0.25%胰蛋白酶消化，轻柔吹打使细胞悬浮，离心后用DMEM培养基制备成浓度为1×104个/ml的细胞悬液。在96孔板每孔接种100 μl，培养24 h至细胞贴壁。用移液器吸去上清，加入150 μl含不同浓度黄芩苷的培养液(黄芩苷的终浓度分别为:50、100和150 μg/ml)，每个药物浓度设3个复孔，同时设不加细胞只加培养液的空白对照孔，继续培养24、48和72 h。吸去培养液每孔加入20 μl MTT，培养4 h后弃上清，每孔加入150 μl DMSO振荡器低速振荡10 min使结晶充分溶解，用酶标仪在450 nm波长下空白孔调零，检测每孔的吸光(A)值，并重复以上实验3次。黄芩苷对细胞的抑制率(inhibition rate，IR)计算公式如下:IR(%)=(A阴性孔－A实验孔)/(A阴性孔－A空白孔)×100%。

1.2.3 Western blotting方法检测JNK蛋白磷酸化:取对数生长期细胞1×104个/ml，接种于细胞培养瓶中，设置 4组细胞，A组加入不含黄芩苷或SP600125的细胞培养液，B组加入 10 μmol/L SP600125，C 组加入 100 μg/ml黄芩苷，D 组用10 μmol/L SP600125 预处理后加入 100 μg/ml黄芩苷。细胞继续培养48 h后去上清，用预冷PBS清洗细胞3次，收集细胞至离心管，加200 μl细胞裂解液充分混匀，冰上放置10 min，4℃、12000 rpm离心5 min，上清转移至干净EP管。通过BCA法测蛋白浓度并用细胞裂解液将各样品蛋白浓度调齐。配制5%的浓缩胶及12%的分离胶进行十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离，冰上200 mA恒流转移蛋白至PVDF膜，10%脱脂奶粉室温封闭2 h，加用10%脱脂奶粉稀释(1:1000)的一抗4℃过夜。用TBST缓冲液充分振摇洗膜5次，加辣根过氧化物酶标记的二抗37℃孵育2 h，TBST缓冲液洗膜5次，每次10 min。加显色液，凝胶图像分析系统拍照，Image J软件分析条带灰度值。

1.2.4 SP600125阻断剂对黄芩苷抑制细胞增殖的影响:在96孔板上接种100 μl处于对数生长期的细胞，加入SP600125(终浓度为10 μmol/L)预处理1 h，吸去 SP600125 后，加入 100 μg/ml黄芩苷培养液，继续培养24、48、72 h，通过 MTT法检测细胞毒性(操作同 1.2.2)。

1.3 统计学分析 所有资料均采用SPSS 18.0软件进行统计学处理，计量资料用均数±标准差(±s)表示，两均数比较采用t检验，多组间比较用单因素方差分析，α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 黄芩苷对HepG2细胞增殖的抑制作用 MTT细胞毒性实验显示黄芩苷对HepG2细胞的增殖具有抑制作用，其抑制强度随药物作用时间的延长而增加，结果见表1和图1。经同一浓度黄芩苷处理的细胞在培养24、48和72 h 3个时间点IR均具有统计学差异(P＜0.01)，黄芩苷对人肝癌HepG2细胞增殖抑制作用呈时间依赖性。50 μg/ml与100 μg/ml黄芩苷处理的细胞在同一培养时间条件下IR均具有统计学差异(24 h:t=－4.15，P=0.014;48 h:t= －4.28，P=0.013;72 h:t= －4.11，P=0.015)，而 100 μg/ml与 150 μg/ml黄芩苷处理的细胞在同一培养时间条件下IR均不具有统计学差异(24 h:t= －0.36，P ＞0.05;48 h:t=-1.83，P ＞0.05;72 h:t= －0.31，P ＞0.05)。黄芩苷浓度低于100 μg/ml其对细胞的抑制作用随浓度升高而增强;当黄芩苷浓度超过100 μg/ml时，其抑制作用不再随浓度升高而增强。

2.2 HepG2细胞中JNK蛋白磷酸化程度比较 黄芩苷刺激后JNK总蛋白表达未见明显变化，但JNK蛋白磷酸化程度升高，加入JNK信号通路特异性抑制剂SP600125后可阻断JNK的磷酸化。见图2。

2.3 SP600125阻断剂处理后黄芩苷对HepG2细胞增殖的影响 细胞在加入黄芩苷前经SP600125预处理后，在3个不同时间点细胞抑制率均低于不经SP600125预处理细胞组(P＜0.01)，结果见表2。

表1 不同浓度的黄芩苷对HepG2细胞增殖的抑制率(±s，%)

表1 不同浓度的黄芩苷对HepG2细胞增殖的抑制率(±s，%)

注:与100 μg/ml比较，aP ＜0.05

黄芩苷浓度(μg/ml) 24 h 48 h 72 h F P 0.01 58.33 ±5.60 40.12 ＜0.01 100 38.01 ±4.72 64.74 ±6.83 81.36 ±7.91 32.75 ＜0.01 150 39.15 ±2.95 73.47 ±4.62 83.61 ±9.51 40.49 ＜50 25.69 ±2.03a 43.92 ±4.95a

图1 不同浓度的黄芩苷对HepG2细胞增殖的抑制作用

图2 4组HepG2细胞JNK磷酸化的变化

表2 HepG2细胞增殖抑制率的比较(±s)

表2 HepG2细胞增殖抑制率的比较(±s)

组别24 h 48 h 72 h黄芩苷38.01 ±4.72 64.74 ±6.83 81.36 ±7.91 SP600125+黄芩苷 8.78 ±2.75 16.31 ±4.10 25.38 ±6.72 t －9.3 -10.5 －9.2 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

3 讨论

常规放化疗和传统中医药主要通过诱导细胞凋亡发挥其抗癌的作用，而放化疗在抑制肿瘤的同时也杀伤人体正常细胞，尤其是免疫细胞。目前，Brnjic［7］和 Bermudez［8］等发现 JNK 信号通路在放化疗诱导细胞凋亡中起重要作用，是抑制肿瘤细胞凋亡必需的信号分子，并且必须持续激活才能达到其诱导细胞凋亡的作用。细胞凋亡为细胞的程序性死亡，凋亡过程受细胞内一系列分子的调控［9-10］。MAPK为一类丝蛋白/苏氨酸蛋白激酶，是细胞内外信号传导的主要传导分子之一，在多种肿瘤发生发展中起到重要作用［11-12］。刺激信号通过激活MAPK激酶、MAPK激酶和MAPK形成磷酸化的三级级联反应，激活下游控制细胞增殖或凋亡的信号分子。真核细胞中已经确认的MAPK信号分子包括ERK、p38MAPK、ERK5 和 JNK［13］。其中，JNK 由 JNK 激酶1、2(MKK4、MKK7)磷酸化后激活，激活后移动至细胞核，与转录因子ATF2结合，促进基因的转录和蛋白的合成［14］。研究发现JNK对细胞具有双向调控机制，不同的细胞类型和不同的刺激方式下，JNK一方面诱导细胞凋亡，一方面促进细胞增殖［15］，其具体机制并不明确，个别研究认为似乎与JNK保持活化的时间长短相关［16］。研究同样发现JNK在肿瘤中的作用复杂而多样，一方面，不少研究发现肿瘤组织中JNK的活性增高，Yeh等［17］发现抑制JNK的表达可以降低乳腺癌MCF-7细胞的生长速率，并且促进乳腺癌MCF-7细胞的凋亡。相反的是，Brosseau等［18］通过 1，25 二羟维生素 D3 激活MCF-7细胞中的JNK信号通路后，发现细胞的凋亡率明显增加。可见，肿瘤细胞内JNK信号通路在不同的诱导剂的作用下可能发挥不同的生物学效应。

传统中医药认为黄芩具有清热燥湿、泻火解毒、安胎的功效，以根入药，《医学衷中参西录》中云“黄芩善入肝胆清热”，可见黄芩同时也是治疗肝脏疾病中一味常用的中药［19］。研究发现黄芩在抗肿瘤的治疗中同样具有显著效果，其有效提取物黄芩苷能够诱导肿瘤细胞的凋亡，且不损伤人体正常细胞［20］。梁慧敏等［21］发现黄芩苷可以诱导人肝癌HepG2细胞的凋亡，细胞凋亡相关蛋白Caspase-9和Caspase-3的表达量均明显增高，其机制尚不清楚。

本研究观察了黄芩苷对人肝癌HepG2细胞毒性作用，并发现黄芩苷确实对HepG2细胞生长有抑制作用，其抑制作用随药物浓度和作用时间的增加而增加，具有量－效、时－效关系，但当黄芩苷浓度超过100 μg/ml时，其抑制作用不再随浓度升高而变化，这可能是在该剂量黄芩苷的刺激下，细胞内的JNK信号通路的激活达到上限。通过Western blotting检测黄芩苷处理后HepG2细胞JNK磷酸化的情况，结果显示黄芩苷处理细胞后，JNK总蛋白表达未见明显变化，而p-JNK蛋白明显上调。该结果表明，黄芩苷确实激活了细胞内JNK信号通路，而且很有可能是通过激活JNK信号通路来诱导HepG2细胞的凋亡。为进一步验证JNK信号通路在细胞凋亡中的作用，通过JNK抑制剂SP600125预处理HepG2细胞后发现SP600125能选择性、可逆性地抑制JNK蛋白活性，阻止JNK的磷酸化以及磷酸化JNK在细胞内的积聚，由此阻断JNK依赖的基因转录及细胞凋亡［22］。通过观察SP600125阻断剂处理后黄芩苷对HepG2细胞增殖的影响发现，HepG2细胞经SP600125预处理后细胞增殖的抑制率明显低于未接受SP600125预处理的细胞。结果表明黄芩苷可通过激活JNK信号通路来诱导HepG2细胞的凋亡，阻断JNK信号通路可降低黄芩苷对HepG2细胞的抑制作用。

以上研究结果显示，用黄芩苷刺激肝癌HepG2细胞确实可以引起细胞凋亡增加，而且黄芩苷通过激活肝癌细胞内JNK信号通路来诱导细胞凋亡，为逐步开发黄芩苷的药理作用奠定基础，但是由于体外实验的局限性，未来仍需要体内实验进一步验证黄芩苷对细胞内JNK信号通路的影响。

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