乳腺癌NOEY2基因启动子区甲基化的研究

刘秀娟，高 静，姜英翰，潘鑫艳，黎贵芸，陈 玥，杨举伦

肿瘤抑制基因NOEY2又名ras同源基因家族成员Ⅰ或ARHI，是母源性印迹、父源性表达的抑癌基因［1-2］。研究发现NOEY2 mRNA的低表达或缺失与卵巢癌、胰腺癌的发生有关［3］。本实验室前期曾在乳腺癌发生模型MCF10的增生细胞系、癌前细胞系、导管内癌细胞系和浸润癌细胞系中检测到NOEY2基因启动子区CpG岛Ⅰ高度甲基化及相应的mRNA表达减少，提示NOEY2基因启动子区甲基化与乳腺癌发生有关［4］。通过免疫组化和原位杂交法，Wang等［5］在正常乳腺组织中检测到NOEY2表达，而在乳腺浸润癌(70%)和导管原位癌(41%)中表达下降。之前乳腺癌中关于NOEY2甲基化及其mRNA表达的研究主要集中在细胞系，而实体乳腺癌组织的研究局限于NOEY2 mRNA及其蛋白的表达，并未同时进行NOEY2甲基化状态研究。因此，本实验用甲基化特异性PCR(methylationspecific PCR，MSP)技术检测乳腺增生和乳腺癌中抑癌基因NOEY2启动子区的甲基化状态，用实时定量PCR检测乳腺浸润性导管癌(IDC)中NOEY2 mRNA表达，探讨NOEY2基因甲基化与乳腺癌发生、发展的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源:收集成都军区昆明总医院2010年1月—2012年1月手术切除乳腺的女性患者标本，其中 IDC组46例，平均年龄44岁，肿瘤直径(3.4±1.5)cm;乳腺普通型导管增生(UDH)组30例，平均年龄46岁;癌旁正常乳腺组织(NBT)组20例，平均年龄42岁;存档蜡块中的乳腺原位导管癌(DCIS)组20例，平均年龄49岁，肿瘤直径(3.0±1.7)cm;乳腺非典型导管增生(ADH)组13例，平均年龄47岁，肿瘤直径(2.5±1.3)cm。IDC临床分期:Ⅰ期10例，Ⅱ期31例，Ⅲ期5例;组织学分级:Ⅰ级17例，Ⅱ级24例，Ⅲ级5例;腋窝淋巴结转移29例;人表皮生长因子受体2(HER2)阳性10例;雌激素受体(ER)阳性26例;孕激素受体(PR)阳性19例。新鲜标本在手术切除后放于液氮中速冻，之后置于－80℃低温冰箱中保存。石蜡标本均经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋。上述标本均经病理医师检查验证和归类(图1～4)。

图2 非典型导管增生(HE×100)

图3 导管原位癌(HE×100)

图4 浸润性导管癌(HE×100)

1.1.2 主要试剂:T4连接酶、BamH I酶、Sal I酶购自Fermentas公司;QIAamp DNA FFPE Tisuue Kit、EpiTect Bisulfite Kit购自QIAGEN公司;D2000 DNA marker、基因组DNA提取试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA提取:按照天根公司DNA提取试剂盒说明书提取新鲜冰冻组织DNA，按照QIAGEN公司QIAamp DNA FFPE Tissue Kit试剂盒说明书提取石蜡组织基因组DNA。用紫外分光光度仪检测提取DNA的含量和纯度。

1.2.2 MSP

1.2.2.1 DNA的亚硫酸氢盐修饰:将样本基因组DNA和用M.SssI酶(CpG甲基转移酶)处理并沉淀的人外周血单个核细胞基因组DNA分别进行亚硫酸氢盐转化，取2 μg DNA于热循环仪中进行亚硫酸转化，程序为:95℃、5 min;60℃、25 min;95℃、5 min;60℃、85 min;95℃、5 min;60℃、175 min，经此反应，DNA中甲基化的胞嘧啶不变，未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，后经脱盐、脱磺酸纯化、洗脱，收集 DNA，修饰后样品于 －20℃避光存储，以进行后续的MSP反应。

1.2.2.2 MSP扩增:NOEY2 CpGⅠ甲基化引物(M)和非甲基化引物(U)序列参考文献［4］，甲基化引物序列为正链:5'-GTATTCGTCGTTAGGCGTTT-3'，反链:5'-CGAAACTTTCGTTATTCTTCGC-3'，产物大小为300 bp;非甲基化引物序列为正链:5'-AATGTTTGGTAGGTGGTGGTG-3'，反 链:5'-CCTCACCAAACCCTCACAAAA-3'，产物大小为225 bp。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。反应体系为25 μl，在 Ependoff热循环仪中按以下条件进行扩增:95℃预变性 5 min，95℃ 变性 30 s，59℃(TM)/57℃(TU)退火45 s，72℃延伸 40 s，扩增 35 个循环之后，PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统扫描观察产物。若只产出甲基化产物，说明此样本目的DNA发生了甲基化;若只产出非甲基化产物，则此样本目的DNA未发生甲基化;若甲基化和非甲基化产物同时存在，说明此样本DNA发生部分甲基化。PCR阴性对照:未经M.SssI处理的健康人外周血单个核细胞DNA;阳性对照:经M.SssI处理的健康人外周血单个核细胞DNA。

1.2.2.3 基因甲基化水平的积分光密度(IOD)判定:使用Quantity One软件测定甲基化条带(M)和非甲基化条带(U)的 IOD，通过计算 IODM/(IODM+IODU)，判定NOEY2基因的甲基化水平。

1.2.3 实时定量PCR检测NOEY2基因mRNA表达水平:从46例IDC中随机抽取30例，提取新鲜乳腺组织总RNA，用RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒反转录合成 cDNA，以cDNA为模板对NOEY2基因进行实时荧光定量PCR检测。NOEY2基因引物序列参考文献［4］，序列为正链:5'-CCGAGCAGCGCATTTGTCTT-3'，反 链:5'-CGATGGGGAACTTATGCAGGTT-3'， 产 物 大 小558 bp;内参基因GAPDH引物由Primer 5设计，序列为正链:5'-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3'，反链:5'-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3'，产 物 大 小108 bp，引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。实时荧光定量PCR在BIO-RAD CFX96TMReal-time System中进行。每个样本重复3次，取其平均值，基因的相对表达量以2-△△CT值表示。反应体系为15 μl，运行程序为 95℃ 预变性 5 min，95℃、10 s，60℃、20 s，72℃、20 s，78℃、20 s，读板，扩增40 个循环，95℃、30 s，60℃、30 s，Melt Curve 65 ～ 95℃:increment 0.5、5 s。内参 GAPDH 做样本内校正，NBT做对照。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行统计学处理。计量资料以中位数±四分位间距(M±Q)表示;应用χ2检验对甲基化率进行统计学分析;应用秩和检验对甲基化水平和基因表达量进行统计分析;采用Spearman等级相关方法分析甲基化水平和基因表达量的相关性;χ2检验分析NOEY2基因甲基化与乳腺癌患者的年龄、肿瘤大小、临床分期、组织学分级等临床病理参数的关系。α=0.05为检验标准。

2 结果

2.1 NOEY2基因启动子甲基化率 甲基化特异性PCR结果显示，未经M.SssI处理的健康人外周血DNA同时扩增出甲基化和非甲基化产物;经M.SssI处理的健康人外周血DNA仅扩增出甲基化产物。NBT组、UDH组、ADH组、DCIS组和IDC组完全甲基化率分别为 0、6.7%、15.4%、20.0%、32.6%。IDC组与NBT组、UDH组组间的甲基化率差异均有统计学意义(χ2=8.440，P=0.004;χ2=7.037，P=0.008)，部分MSP结果见图5。

图5 乳腺浸润癌NOEY2基因启动子甲基化MSP分析

2.2 NOEY2基因启动子甲基化水平 NOEY2基因的甲基化水平 IDC组为0.546±0.297，DCIS组为0.299 ±0.496，ADH 组为0.270 ±0.336，UDH 组为0.251 ±0.327，NBT 组为 0.178 ±0.239，各组间甲基化水平差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 NOEY2基因启动子区CpG岛Ⅰ基因启动子甲基化与IDC临床病理参数的关系 46例IDC标本中NOEY2 CpG岛Ⅰ完全甲基化15例，其与患者的组织学分级、临床分期有关(P＜0.05)，而与年龄、肿瘤大小、ER表达、PR表达、HER2扩增无相关性(P ＞0.05)，见表1。

2.4 NOEY2 mRNA在IDC中的表达 30例IDC标本中完全甲基化组(9例)NOEY2 mRNA表达量为0.076 ±0.091，部分甲基化组(21 例)NOEY2 mRNA 表达量为 0.733 ±1.597，完全甲基化组NOEY2 mRNA表达量低于部分甲基化组，经秩和检验，两组间比较差异有统计学意义(P=0.022)。21例部分甲基化标本中有7例NOEY2 mRNA表达近乎缺失。

2.5 IDC中NOEY2基因启动子甲基化状态与mRNA表达量的关系 NOEY2基因启动子区CpG岛Ⅰ甲基化水平与其mRNA表达水平呈负相关关系(r= －0.659，P ＜0.05)。

表1 乳腺浸润癌NOEY2基因启动子区CpG岛Ⅰ完全甲基化与临床病理参数的关系(n=46)

3 讨论

乳腺癌的发生包括基因的遗传学改变和表观遗传学改变。表观遗传学改变是指DNA序列不改变的前提下，通过某些机制引起的基因表达或细胞表现型的变化，发生在转录或翻译过程，具有遗传性和可逆性［6］。而DNA甲基化是目前研究最清楚、最重要的表观遗传修饰形式。癌基因的去甲基化可导致癌基因激活，抑癌基因启动子区甲基化可导致转录沉默而表达减少［7］。此外，具有肿瘤抑制功能的miRNA在乳腺肿瘤细胞中也通过高甲基化失活［8］。乳腺癌中常发生甲基化的基因有 ER［9］，PR［10］，BRCA1［11］， E-cadherin［12］， P16INK4a/CDKN2A/MTS［13-14］，RARβ2 等［15］。

人NOEY2基因定位于1p31，长约8 kb，包括位于启动子区的CpG岛Ⅰ，跨越启动子和第1个外显子的CpG岛Ⅱ以及位于第2个外显子内的CpG岛Ⅲ［2］。NOEY2参与细胞周期调控和信号通路转导，从而负向调节细胞生长［1］。本实验室前期研究发现NOEY2基因突变与乳腺癌发生相关，从遗传学角度探讨了NOEY2基因失活导致乳腺癌发生的机制，但尚有部分乳腺癌NOEY2表达缺失难以单纯用基因突变来解释，提示有其他机制导致NOEY2失活［16］。本实验将 NBT、UDH、ADH、DCIS 及 IDC纳入研究对象，在表观遗传学层面，研究实体乳腺癌的发生、发展过程中有关NOEY2基因的甲基化及其表达的作用。

本研究结果显示NBT、UDH、ADH、DCIS及IDC中NOEY2启动子区CpG岛Ⅰ的完全甲基化率分别为0、6.7%、15.4%、20.0%、32.6%，呈升高趋势。由于NOEY2母源性等位基因甲基化印迹机理，用MSP法检测正常乳腺组织呈部分甲基化状态。乳腺癌NOEY2完全甲基化见于癌变的整个过程，且随着病变进展，完全甲基化率升高说明NOEY2甲基化在乳腺癌发生过程中起作用。由于NOEY2母源性甲基化印迹基因的特殊性，正常部分甲基化和异常部分甲基化难以区分。为此，我们采用甲基化相对定量的方法，测定MSP结果的电泳条带积分光密度并计算甲基化水平，经统计学分析，UDH、ADH、DCIS、IDC和NBT的甲基化水平比较无差异，但在这些标本中检测到5例IDC、3例DCIS和2例UDH的甲基化水平较高，均为正常表达水平的1.5倍以上，说明这几例部分甲基化标本发生了异常甲基化。有研究显示，14-3-3、cyclinD2［17］、ASSF1A、p16［18］基因的甲基化频率和水平在乳腺癌发生的各阶段中也在一定差异，表明特定乳腺癌相关基因的甲基化改变与乳腺癌发生有关［19］。

本研究发现，9例完全甲基化的乳腺浸润癌中NOEY2 mRNA表达水平低于21例部分甲基化的IDC标本，且30例IDC中NOEY2基因的甲基化水平和其mRNA表达量存在负相关关系，说明乳腺癌发生过程中NOEY2启动子区CpG岛Ⅰ的异常甲基化是导致其表达失活的重要原因之一。进一步结合临床病理资料进行统计学分析发现:NOEY2启动子区CpG岛Ⅰ完全甲基化与乳腺癌患者肿瘤的组织学分级、临床分期相关，而与年龄、ER表达、PR表达、Her2的扩增无关，这进一步说明NOEY2启动子区CpG岛Ⅰ异常甲基化与乳腺癌的进展相关。

本研究还发现，抽取的30例 IDC中有7例NOEY2启动子区CpG岛Ⅰ并未发生完全甲基化，但NOEY2 mRNA表达近乎缺失，研究认为除启动子区CpG岛甲基化可导致基因表达沉默外，编码区的CpG岛甲基化也能抑制基因的表达，并可发展至启动子区使之失活［20］。而本实验我们只检测了NOEY2启动子区CpG岛Ⅰ在乳腺癌中的甲基化状态与NOEY2 mRNA表达之间的关系，CpG岛Ⅱ、CpG岛Ⅲ是否发生甲基化以及3个CpG岛的甲基化状态与NOEY2 mRNA表达之间有何相关性，都有待进一步探索。

［1］Yu Y，Xu F，Peng H，et al.NOEY2(ARHI)，an imprinted putative tumor suppressor gene in ovarian and breast carcinomas［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1999，96(1):214-219.

［2］Joo M K，Kim K H，Park J J，et al.CpG island promoter hypermethylation of Ras association domain family 1A gene contributes to gastric carcinogenesis［J］.Mol Med Rep，2014，3(7):243-251.

［3］Yu Y，Fujii S，Yuan J，et al.Epigenetic regulation of ARHI in breast and ovarian cancer cells［J］.Ann N Y Acad Sci，2003，98(3):268-277.

［4］杨举伦，Klinkebiel D，Boland M J.乳腺癌发生过程中NOEY2基因启动子区甲基化及mRNA表达［J］.临床与实验病理学杂志，2005，25(5):543-547.

［5］Wang L，Hoque A，Luo R Z，et al.Loss of the expression of the tumor suppressor gene ARHI is associated with progression of breast cancer［J］.Clin Cancer Res，2003，9(10):3660-3666.

［6］Varriale A.DNA Methylation，Epigenetics，and Evolution in Vertebrates:Facts and Challenges［J］.Int J Evol Biol，2014，2014:475981.

［7］Baubec T，Schubeler D.Genomic patterns and context specific interpretation of DNA methylation［J］.Curr Opin Genet Dev，2014，25(3):85-92.

［8］Avraham A，Cho S S，Uhlmann R，et al.Tissue specific DNA methylation in normal human breast epithelium and in breast cancer［J］.PloS one，2014，9(3):e91805.

［9］Lapidus R G，Nass S J，Butash K A，et al.Mapping of ER gene CpG island methylation-specific polymerase chain reaction［J］.Cancer Res，1998，58(12):2515-2519.

［10］Ferguson M J，Hushagen R W，Mar A.A New Family of Nonstoichiometric Layered Rare-Earth Tin Antimonides，RESn(x)()Sb(2)(RE=La，Ce，Pr，Nd，Sm):Crystal Structure of LaSn(0.75)Sb(2)［J］.Inorg Chem，1996，35(15):4505-4512.

［11］Catteau A，Harris W H，Xu C F，et al.Methylation of the BRCA1 promoter region in sporadic breast and ovarian cancer:correlation with disease characteristics［J］.Oncogene，1999，18(11):1957-1965.

［12］Nass S J，Herman J G，Gabrielson E，et al.Aberrant methylation of the estrogen receptor and E-cadherin 5＇CpG islands increases with malignant progression in human breast cancer［J］.Cancer Res，2000，60(16):4346-4348.

［13］Muscarella P，Bloomston M，Brewer A R，et al.Expression of the p16INK4A/Cdkn2a gene is prevalently downregulated in human pheochromocytoma tumor specimens［J］.Gene Expr，2008，14(4):207-216.

［14］Woodcock D M，Linsenmeyer M E，Doherty J P，et al.DNA methylation in the promoter region of the p16(CDKN2/MTS-1/INK4A)gene in human breast tumours［J］.Br J Cancer，1999，79(2):251-256.

［15］Swafford D S，Middleton S K，Palmisano W A，et al.Frequent aberrant methylation of p16INK4a in primary rat lung tumors［J］.Mol Cell Biol，1997，17(3):1366-1374.

［16］胡爱平.乳腺癌NOEY2基因突变谱研究［D］.昆明:昆明医学院，2007.

［17］Sharma G，Mirza S，Prasad C P，et al.Promoter hypermethylation of p16INK4A，p14ARF，CyclinD2 and Slit2 in serum and tumor DNA from breast cancer patients［J］.Life sci，2007，80(20):1873-1881.

［18］Lee J J，Ko E，Cho J，et al.Methylation and Immunoexpression of p16(INK4a)Tumor Suppressor Gene in Primary Breast Cancer Tissue and Their Quantitative p16(INK4a)Hypermethylation in Plasma by Real-Time PCR［J］.Korean J Pathol，2012，46(6):554-561.

［19］Lehmann U，Langer F，Feist H，et al.Quantitative assessment of promoter hypermethylation during breast cancer development［J］.Am J Pathol，2002，160(2):605-612.

［20］Maegawa S，Yoshioka H，Itaba N，et al.Epigenetic silencing of PEG3 gene expression in human glioma cell lines［J］.Mol Carcinog，2001，31(1):1-9.