辛伐他汀对慢性阻塞性肺病模型大鼠的治疗作用及其机制研究

张立海，史亚楠，李新玲，王丽红，王雅杰，孙武装

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是以持续气流受限为主要特征，支气管炎、肺气肿为主要表现的一种慢性疾病［1］。研究显示，该病与有害颗粒、气体侵及机体气道、肺部形成慢性的炎性反应关系密切［2］。据文献报道，COPD发病率正呈逐年升高态势［3］。治疗方案应以缓解症状为主，兼顾对炎性细胞、炎性介质释放给予有效抑制，最终达到改善生存质量的目的。他汀类药物能够对炎性细胞黏附给予选择性抑制，同时可以降低肿瘤坏死因子(TNF)-α水平、抑制炎性细胞浸润［4］。本文选取雄性SD大鼠建立COPD模型，旨在探讨辛伐他汀治疗的作用机制，报告如下。

1 资料与方法

1.1 实验动物 选择体质量为160～250 g的雄性健康SD大鼠60只，由河北医科大学实验动物中心提供。标准饲料饲养，白昼与夜晚均为12 h，25℃室温，空气湿度为50.0% ～60.0%，自由饮水，清洁卫生的饲养环境，保持通风。在实验前全部大鼠禁食12 h，未限制饮水。

1.2 方法 将SD大鼠60只，随机分为研究组、模型组、对照组，每组20只，研究组、模型组大鼠第1、15 天，0.3%戊巴比妥钠溶液麻醉(0.01 ml/g)，气管插管方式予2 ml脂多糖气道注入(200 μg)，直立旋转10～20 s，1次/d。第2～14、16～28天，置于玻璃密闭熏烟箱中，持续吸入香烟烟雾，15支/d，建立COPD模型。14 d后研究组予辛伐他汀(厂家:杭州默沙东制药有限公司)灌胃(2.5 mg/kg)1次/d，模型组、对照组予等量生理盐水灌胃，1次/d，连续8周。

1.3 标本获取 称重大鼠，10.0%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，切开胸部，暴露气管及肺部，从心脏取血 5 ml，3500 r/min，离心半径20 cm，离心10 min，取血清－20℃保存。结扎右主支气管，于隆突上用套管针穿刺至左肺，以2 ml生理盐水灌洗左肺，再缓慢回抽，每次回收液体约1.5 ml，如此反复灌洗3次，回收率约75.0%。混匀灌洗液，先取0.5 ml用细胞计数板行支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)细胞计数，余下液体4℃、1000 r/min，离心半径 20 cm，离心10 min，取上清液－20℃保存。取沉渣涂片，瑞氏染色，按照形态学标准进行细胞分类。将所有大鼠处死同时离取肺部组织，制成切片。

1.4 观察指标 观察对比3组BALF细胞总数、分类计数水平，观察对比3组BALF中白介素(IL)-8、TNF-α 浓度及血清中 IL-8、TNF-α、C 反应蛋白(CRP)浓度。

1.5 统计学处理 选择SPSS 19.0软件对数据予以统计处理，其中计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用方差分析，α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 3组病理形态学表现 模型组与研究组大鼠支气管管壁及血管周围均有多种炎性细胞浸润，以中性粒细胞为主，上皮细胞大量脱落，纤毛倒伏、脱落明显，气管壁断裂、增厚明显，管腔狭窄，肺泡壁变薄，大量融合形成大疱。对照组未发生上述情况，见图1。

图1 3组大鼠肺部病理组织比较(HE×400)

2.2 3组BALF细胞总数、分类计数水平对比 3组细胞总数比较，均有明显差异(P＜0.05)，中性粒细胞、单核－巨噬细胞、淋巴细胞百分比3组也均有明显差异(P＜0.05)。见表1。

2.3 3组BALF中的IL-8、TNF-α浓度对比 BALF中的IL-8、TNF-α浓度3组相比较，均有明显差异(P ＜0.05)，见表2。

2.4 3组大鼠血清IL-8、TNF-α、CRP浓度对比 3组血清IL-8、TNF-α、CRP浓度相比较，均有明显差异(P ＜0.05)，见表3。

表1 3组大鼠肺泡灌洗液细胞总数、分类计数水平比较(±s)

表1 3组大鼠肺泡灌洗液细胞总数、分类计数水平比较(±s)

注:研究组、模型组大鼠建立COPD模型，2周后研究组予辛伐他汀灌胃，模型组、对照组予生理盐水灌胃

组别 例 细胞总数(108/L) 中性粒细胞(%) 单核－巨噬细胞(%) 淋巴细胞(%)研究组 20 3.62 ±0.28 25.76 ±2.93 62.87 ±3.26 11.27 ±1.58模型组 20 7.85 ±0.27 29.17 ±4.08 55.53 ±4.41 15.19 ±5.13对照组 20 1.57 ±0.18 11.69 ±2.25 79.25 ±2.86 9.04 ±1.87 F 4.172 4.336 5.129 4.131 P ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

表2 3组大鼠肺泡灌洗液的白介素(IL)-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α浓度对比(±s)

表2 3组大鼠肺泡灌洗液的白介素(IL)-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α浓度对比(±s)

注:研究组、模型组大鼠建立COPD模型，2周后研究组予辛伐他汀灌胃，模型组、对照组予生理盐水灌胃

组别 例 IL-8(pg/ml) TNF-α(pg/ml)研究组20 20.66 ±1.49 28.64 ±1.79模型组 20 24.93 ±2.83 34.85 ±4.21对照组 20 16.15 ±2.12 21.97 ±3.64 F 4.614 5.228 P ＜0.05 ＜0.05

表3 3组大鼠血清白介素(IL)-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α、C反应蛋白(CRP)浓度比较(±s)

表3 3组大鼠血清白介素(IL)-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α、C反应蛋白(CRP)浓度比较(±s)

注:研究组、模型组大鼠建立COPD模型，2周后研究组予辛伐他汀灌胃，模型组、对照组予生理盐水灌胃

组别 例 IL-8(pg/ml)TNF-α(pg/ml)CRP(mg/L)研究组20 22.73 ±3.17 12.34 ±0.62 1.49 ±0.17模型组 20 30.51 ±3.36 12.85 ±0.83 1.74 ±0.22对照组 20 16.78 ±1.58 9.22 ±0.53 1.14 ±0.26 F 4.175 4.683 5.119 P ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 讨论

COPD早期的造模方法是单纯烟熏，烟熏是诱发COPD动物模型的必要条件，大量吸烟和反复呼吸系统感染是人类COPD形成的重要病因［5］。香烟烟雾中含有的焦油、尼古丁、丙烯醛、氢氰酸、过氧化物等化学物质能损坏气道纤毛上皮细胞及肺泡上皮细胞等，使得纤毛脱落，运动及防御能力下降，上皮细胞及肺泡细胞增生、化生和坏死［6］，烟雾中的氧自由基能活化中性粒细胞和肺泡巨噬细胞生成更多的氧自由基，循环加剧［7］。同时烟雾可使气道上皮细胞和肺泡上皮细胞的通透性增加，造成抗胰蛋白酶系统失衡，导致肺气肿形成，并增加肺部感染概率［8］。当肺部受革兰阴性细菌感染后，机体免疫系统被激活，细菌裂解胞膜释放脂多糖，可直接造成上皮细胞的损伤，进一步加重肺部炎症［9］。

研究显示［10］，通过烟熏和气管内注入脂多糖的方法模拟COPD的主要致病因素，可造成COPD大鼠模型。本实验COPD模型组大鼠支气管管壁及血管周围均有多种炎性细胞浸润，以中性粒细胞为主，上皮细胞大量脱落，纤毛倒伏、脱落明显，气管壁断裂、增厚明显，管腔狭窄，肺泡壁变薄，大量融合形成大疱等典型COPD病理学特征［11］。以上从病理形态学证明了该法制备 COPD模型的可行性［12］。COPD的气道炎症以淋巴细胞、肺泡巨噬细胞和中性粒细胞浸润为主，被激活的炎性细胞可释放许多炎性介质及细胞因子，直接参与COPD气道炎症的进展［13］。IL-8能够趋化、活化白细胞，抑制中性粒细胞凋亡，延长中性粒细胞寿命，对COPD的气道炎症起着引发、维持、甚至加重的重要作用［14］。TNF-α仅可以增强白细胞对损伤的免疫反应，以自分泌形式作用于单核巨噬细胞使其释放各种炎性介质，增加对病原体的吞噬和消化，并促进炎性细胞因子的释放，但同时也扩大了炎性反应，引起组织损伤［14］。本文观察发现，3组细胞总数比较，均呈明显差异，中性粒细胞、单核－巨噬细胞、淋巴细胞百分比3组比较，也均呈明显差异，这说明COPD大鼠应用辛伐他汀治疗，对炎性细胞水平具有显著降低的作用。

3组BALF中的IL-8、TNF-α浓度比较，均呈明显差异，以及血清 IL-8、TNF-α、CRP浓度也均呈明显差异。由于他汀类药物可选择性抑制炎性细胞的黏附，并明显抑制炎性细胞的浸润，通过减少TNF-α等细胞因子的分泌来减轻炎症反应［15］。研究显示通过观察大量COPD肺功能的资料发现，使用过他汀类药物的患者肺功能比未使用过的患者有明显的改善，充分证明了他汀类药物可缓解肺功能下降程度［13］。另据文献报道［14］，使用他汀类药物可以降低COPD患者的发病率和死亡率，而且还具有抗氧化、抗金属蛋白酶、抗炎症介质、抗炎性细胞因子、降低CRP的作用。

综上所述，COPD大鼠应用辛伐他汀治疗，通过使BALF、血清中的炎症因子降低，减轻气道、肺组织炎症，从而达到治疗目的。

［1］李玉屏，罗百灵，张立，等.白藜芦醇减轻慢性阻塞性肺疾病大鼠内质网应激诱导的肺泡上皮细胞凋亡研究［J］.中华结核和呼吸杂志，2014，37(1):30-35.

［2］李渺苗，辛晓峰，邵宏涛，等.神经生长因子及其酪氨酸激酶A受体在慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡巨噬细胞中的表达［J］.中华结核和呼吸杂志，2012，35(8):601-605.

［3］袁浩，罗百灵，何白梅.红霉素对慢性阻塞性肺疾病大鼠转化生长因子-β1和分泌型白细胞蛋白酶抑制剂表达水平的影响［J］.中华结核和呼吸杂志，2011，34(7):523-527.

［4］李泽庚，王传博，方莉，等.中华中医药学会2013年学术年会论文集［C］.北京［出版者不详］，2013.

［5］龙翔，宋卫东，刘媛媛，等.慢性阻塞性肺疾病大鼠肺树突细胞数量及成熟度变化与慢性炎症的关系［J］.中华结核和呼吸杂志，2011，34(8):609-613.

［6］胡亦新，范利，崔华，等.阿托伐他汀对老年慢性阻塞性肺病大鼠心肌和血管损伤的影响［J］.中华老年心脑血管病杂志，2010，12(4):351-354.

［7］江德鹏，李琪，维克多·克罗索夫，等.携分泌型白细胞蛋白酶抑制因子的间充质干细胞对慢性阻塞性肺疾病大鼠的治疗作用［J］.中华医学杂志，2011，91(48):3438-3441.

［8］何白梅，罗百灵，彭振宇，等.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的肺组织内质网应激与细胞凋亡［J］.中华结核和呼吸杂志，2011，34(5):375-379.

［9］马碧蔓，刘朝晖，梁志科，等.蛋白酶体抑制剂MG-132抑制慢性阻塞性肺疾病大鼠模型膈肌萎缩的研究［J］.中华结核和呼吸杂志，2013，36(6):441-446.

［10］崔金霞，张永东，时莹庆，等.高海拔COPD大鼠血浆TNF-α、IL-6和 IL-10水平升高［J］.基础医学与临床，2014，34(8):1108-1109.

［11］许森赫，孙连坤，范丽雯，等.P38抑制剂CDS1124对大鼠COPD的干预作用［J］.中国实验诊断学，2014(6):883-885.

［12］尚立芝，谢文英，张良芝，等.爱罗咳喘宁对慢性阻塞性肺疾病大鼠白三烯B4、白细胞介素-6及肺组织病理形态的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20(12):170-173.

［13］谢文英，尚立芝，潘晓丽，等.爱罗咳喘宁对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能、血气指标及病理变化的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20(22):117-122.

［14］邝少松，严家荣，钟志勇，等.克咳片对老年大鼠慢性阻塞性肺疾病的治疗作用［J］.中国药理学与毒理学杂志，2014，28(1):29-34.

［15］韩婧，张朝杰，张程，等.甲泼尼龙琥珀酸钠对自身免疫性肺气肿大鼠肺泡隔细胞凋亡的影响［J］.中国生化药物杂志，2014(4):36-39.