顺铂不同疗程化疗对裸鼠人卵巢癌移植瘤的影响

苗 蕊，郭 婧，刘秀萍，张彩虹

卵巢上皮癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是致死率最高的妇科恶性疾病［1］。绝大部分卵巢癌患者在确诊时已是临床晚期，70%患者经过手术和化疗后肿瘤仍复发，并且呈现化疗耐药［2］。传统化疗一般选择细胞毒性药物最大耐受剂量化疗，常规为6～8个疗程，此种化疗方案可以有效控制肿瘤。但也会产生多种不良反应，降低患者的生活质量，并且残余肿瘤耐药性更强［2］。本实验给予荷人卵巢癌裸鼠顺铂(DDP)最大可耐受剂量化疗，疗程分别为4和8个，观察不同化疗疗程对裸鼠皮下移植瘤生长情况及裸鼠体重的影响，分析不同化疗疗程对肿瘤增长、耐药及复发的影响并探讨其可能的机制。

1 材料和方法

1.1 细胞株 人卵巢浆液性癌细胞株SKOV3，购自中科院上海细胞库。接种于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，置于恒温37℃、含5%CO2的培养箱中。

1.2 实验动物 雌性Balb/c裸小鼠24只，6～8周龄，体重16～18 g，由中国军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号:SCXK(军)2012-0004。在SPF级条件下饲养，所有动物实验操作过程均遵照国际动物委员会制定的伦理道德规范。

1.3 模型制备及分组 将1×107个SKOV3细胞接种于裸鼠右侧大腿皮下建立人卵巢癌异种移植瘤模型。移植瘤体积达150～200 mm3时将24只裸鼠随机分为对照组、短疗程化疗组和足疗程化疗组，每组8只。短疗程化疗组给予DDP 3 mg/kg，腹腔注射，每3天1个疗程，共4个疗程;足疗程化疗组给予DDP 3 mg/kg，腹腔注射，每3天1个疗程，共8个疗程;对照组给予等量生理盐水，腹腔注射，每3天1个疗程，共8个疗程。3组均于疗程结束后处死裸鼠取皮下移植瘤组织。

1.4 标本采集 在无菌条件下取出裸鼠皮下移植瘤，移植瘤组织提取总蛋白后保存于－80℃条件下，以备Western blot方法使用。

1.5 主要试剂 Anti-BCRP抗体，购自美国Millipore公司;Anti-LRP1抗体购自美国Abcam公司;Anti-ALDH抗体，购自美国Millipore公司。

1.6 观察指标 每3天测量裸鼠皮下移植瘤长径(a)及与其垂直的短径(b)，根据体积计算公式:V=1/2ab2计算移植瘤体积;每3天称量裸鼠体重，并观察移植瘤组织中干细胞标记物和耐药相关蛋白的表达情况。

1.7 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件对数据进行处理，计量资料以均数±标准差(±s)表示，3组及以上比较采用方差分析，组间比较采用LSD法，α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 裸鼠皮下移植瘤体积变化 化疗前3组裸鼠皮下移植瘤体积和体重比较差异无统计学意义(P＞0.05)，化疗过程中3组裸鼠皮下移植瘤均处于不断增大状态，化疗后3组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，其中短疗程化疗组和足疗程化疗组皮下移植瘤体积均小于对照组，且足疗程化疗组小于短疗程化疗组(P＜0.01);足疗程化疗组体重低于对照组及短疗程化疗组(P＜0.05，P＜0.01)，但短疗程化疗组裸鼠体重与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 3组裸鼠化疗前后皮下移植瘤体积及体重变化情况(±s)

表1 3组裸鼠化疗前后皮下移植瘤体积及体重变化情况(±s)

注:与对照组比较，bP＜0.01;与短疗程化疗组比较，aP＜0.05，dP＜0.01

体重(g)组别 鼠数 皮下移植瘤体积(mm3)化疗前 化疗后 化疗前 化疗后对照组 8 176.00 ±41.58 767.06 ±113.87 21.62 ±0.8520.39 ±2.36短疗程化疗组 8 187.74 ±55.63 570.68 ±82.45b 20.68 ±2.22 19.50 ±2.85足疗程化疗组 8 203.10 ±51.51 430.33 ±79.57bd 21.61 ±2.12 17.31 ±1.58ab F＞0.05 ＜0.05 ＞0.05 ＜0.05 0.593 26.308 0.917 3.715 P

2.2 干细胞标记物及耐药相关蛋白表达水平 3组裸鼠移植瘤组织中 CD133、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)、P-糖蛋白(P-gp)表达水平比较差异有统计学意义(P ＜0.05)。CD133、BCRP、P-gp表达水平足疗程化疗组高于对照组及短疗程化疗组(P＜0.01，P＜0.05)，但短疗程化疗组与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2，图1。

3 讨论

目前卵巢癌的标准一线治疗方案是肿瘤细胞减灭术加术后含铂类药物最大耐受剂量化疗6～8个周期［3-5］。DDP足疗程化疗可以有效抑制肿瘤生长，但是化疗药物的特异性选择性不强，一些化疗毒性反应如恶心呕吐、骨髓抑制、毛发脱落等是不可避免的。因此每2个化疗周期有1个间歇期，以便正常细胞恢复功能［6］。

Marx［7］认为肿瘤复发及耐药是由肿瘤细胞中所占比例极小的肿瘤干细胞(CSC)引起的。Baba等［8］首次把 CD133定义为卵巢癌干细胞标记物。Steg等［9］发现，在未化疗的原发卵巢癌组织中CD133表达低，化疗后CD133表达增加，提示肿瘤干细胞能逃避化疗而优先存活并导致肿瘤复发。研究报道，卵巢肿瘤细胞表达CD133是影响预后的一个消极因素［10］。研究发现，卵巢癌组织中表达CD133的患者预后不良，其生存期和无病生存期都较短，肿瘤复发风险更高［10］。有学者认为肿瘤耐药与ABC转运蛋白在干细胞高水平表达有关［11］。BCRP、P-gp是ABC转运蛋白家族，它们可以将化疗药物从细胞中“挤出”，从而影响药物的吸收和分布，改变药物的疗效和毒性。在耐药细胞中，BCRP在质膜中占主导优势［12］，其在质膜上形成二聚体，可以将多种无关物质从细胞中“挤出”。徐志宏等［13］提出BCRP、P-gp表达增强与肿瘤细胞的化疗反应性差相关，BCRP的过度表达与肿瘤复发明显相关，在诱导化疗药物介导的获得性耐药方面起很大作用。BCRP过度表达的肿瘤细胞对多种化疗药物呈现出抵抗性。

表2 3组裸鼠移植瘤组织中干细胞标记物及耐药相关蛋白表达水平(±s)

表2 3组裸鼠移植瘤组织中干细胞标记物及耐药相关蛋白表达水平(±s)

注:与对照组比较，aP＜0.05，bP＜0.01;与短疗程化疗组比较，dP＜0.01

分组 鼠数CD133 BCRP P-gp对照组8 0.26 ±0.09 0.32 ±0.05 0.30 ±0.00短疗程化疗组 8 0.33 ±0.08 0.34 ±0.03 0.33 ±0.05足疗程化疗组 8 0.45 ±0.04bd 0.40 ±0.07ad 0.39 ±0.04bd F 12.423 4.446 9.484 P ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

图1 3组裸鼠移植瘤中CD133、BCRP、P-gp蛋白表达水平

本研究结果显示，对照组裸鼠皮下移植瘤体积最大，短疗程化疗组次之，足疗程化疗组移植瘤体积最小，但足疗程化疗组裸鼠体重低于对照组及短疗程化疗组。足疗程化疗组CD133、BCRP、P-gp蛋白表达水平高于对照组和短疗程化疗组，而短疗程化疗组与对照组之间比较CD133、BCRP、P-gp蛋白表达水平比较差异无统计学意义。提示，与短疗程化疗比较，足疗程化疗抑瘤效果较好，且足疗程能使残余瘤组织中具有部分干细胞特性且耐药相关蛋白高度表达的肿瘤细胞富集，可能使复发肿瘤耐药性更强，更难治疗。

综上所述，目前常规使用的6～8个疗程足量化疗抑瘤效果虽较好，但毒性反应重且复发肿瘤耐药性可能更强。

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