非小细胞肺癌患者肿瘤组织中EGFR、K-Ras和BRAF基因突变的分子病理检测分析

宋业颖，许春伟，吴永芳，班 怡，张 博，李晓兵

肺癌的发病率和死亡率逐渐攀升，已跃居恶性肿瘤之首，肺癌患者中有80%以上为非小细胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)，而且确诊时约60%为晚期患者［1-6］。尽管在化疗、放疗等综合治疗手段上有很大改进，但总体疗效已达瓶颈，其总的5年生存率仍低于20%［6-8］。近年来针对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)的靶向药物已经成功应用于NSCLC治疗，很大程度上延长了患者的生存时间和改善了生活质量。研究发现部分患者对以 Gefitibib、Erlotinib、Icotinib和 Afatinib药物为代表的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)治疗效果敏感。EGFR体细胞突变对Gefitibib和Erlotinib药物治疗后的潜在临床反应起决定作用，EGFR基因结构域的3个外显子(外显子18、19和21)发生突变的患者对EGFR-TKI药物的反应性更好，而EGFR基因外显子20发生突变、K-Ras基因外显子12、13和61以及BRAF基因V600E发生突变的患者对EGFR-TKI药物的反应性差［9-11］。本研究通过直接测序法获得基因突变类型，分析 NSCLC患者 EGFR基因、K-Ras基因和BRAF基因突变情况，为判断疾病发展过程、预后及EGFR-TKI靶向治疗提供分子病理学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 一般材料:收集军事医学科学院附属医院2011年1月—2014年3月经手术切除、穿刺活检及会诊NSCLC标本550例。

1.1.2 主要试剂和仪器:FFDE样本DNA分离试剂盒购自福建厦门艾德生物医药科技有限公司，核酸蛋白质浓度测量仪B-500购自上海创萌生物科技有限公司，Mx3000P实时荧光定量PCR仪购自美国Stratagene公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取:采用福建厦门艾德生物医药科技有限公司的FFPE样本DNA分离试剂盒提取组织，比照苏木精－伊红染色(HE)在显微镜下标记肿瘤区域，切片过程中仅选取相关肿瘤区域，将含有肿瘤区域的DNA组织的蜡块10 μm厚连续切片5张，严格按照试剂盒说明步骤进行操作。DNA提取后应用紫外分光光度计测量DNA质量及浓度。按照测量的DNA浓度稀释至2～5 mg/L备用。

1.2.2 PCR扩增:PCR反应体系(50 μl):2×Taq PCR Master Mix 25 μl;DNA 模板 2 μl;上、下游引物各2 μl(10 pmol);灭菌去离子水19 μl。反应条件:94℃预变性 5 min;94℃、30 s，56℃、45 s，72℃、1 min，共45 个循环;72℃延伸5 min，4℃冷却5 min。灭菌去离子水代替模板作为阴性对照。PCR扩增产物送北京迪诺基因科技有限公司纯化并测序，有突变的病例再行反向测序证实，确定基因突变类型。

2 结果

2.1 EGFR基因突变分析 550例NSCLC共204例(37.09%)检测到 EGFR基因突变，其中8例(1.45%)检测到EGFR基因18外显子突变;116例(21.09%)检测到EGFR基因19外显子突变;20例(3.64%)检测到EGFR基因20外显子突变;61例(11.09%)检测到EGFR基因21外显子突变，见表1。EGFR基因各外显子之间双重突变共13例(2.36%)，其中18外显子与19外显子双重突变1例(0.18%)，18外显子与20外显子双重突变1例(0.18%)，19外显子与20外显子双重突变7例(1.27%)，19外显子与21外显子双重突变4例(0.73%)，见表2。EGFR基因各外显子内双重突变共12例(2.18%)，其中18外显子内无双重突变，19外显子内双重突变共9例(1.64%)，20外显子双重突变共2例(0.36%)，21外显子双重突变共1例(0.18%)。见表3。

表1 550例非小细胞肺癌患者EGFR基因突变220例突变位点分析

表2 13例EGFR基因各外显子间双重突变资料

表3 12例EGFR基因各外显子内双重突变资料

2.2 K-Ras基因突变和BRAF基因突变分析 550例中有11例(2.00%)检测到K-Ras基因突变，其中10例(1.82%)检测到第2号外显子12密码子突变，包含G12C点突变3例(0.55%)，G12D点突变2例(0.36%)，G12V 点突变 4 例(0.73%)，G12S点突变1例(0.18%)，未见G12A和G12R点突变;其中1例(0.18%)检测到K-Ras基因13密码子突变，为G13D点突变，未检测到G13C点突变;本次检测未见到K-Ras基因61密码子Q61H、Q61L和Q61R点突变;BRAF基因V600E点突变2例，未见V600D和V600R点突变。

3 讨论

EGFR是酪氨酸激酶I型受体家族的成员之一，它包含有一个细胞外配体结合区、单一的跨膜区和一个含酪氨酸激酶结构的胞内区。EGFR与配体结合导致重要的构象变化，暴露受体中的二聚环结构，引发自身磷酸化，转导下游信号，调节细胞的增殖、凋亡、迁移、存活和一系列复杂的过程。NSCLC患者中EGFR基因突变主要发生在胞内TK区域前四个(18-21)外显子上，目前报道发现的TK区域突变有30多种［12］，最常见的19和21外显子突变约占85%［13］。本研究显示，EGFR基因的总突变率为37.09%(204/550)，明显高于西方人群［11，14-15］。EGFR基因4个外显子中19和21外显子突变率为86.76%(177/204)，与以往文献报道相符［13］。其中19外显子突变占总突变56.86%(116/204)，且以缺失突变为主，点突变及插入突变少见;21外显子突变占总突变29.90%(61/204)，且以L858R点突变为主，其他位点突变少见;18外显子突变占总突变3.92%(8/204)，其中以G719X突变(G719A/S/C)点突变为主;20外显子突变占总突变9.80%(20/204)，其中以Q787Q同义点突变为主，T790M点突变占15.00%(3/20)。据以上分析得知:18、19和21外显子累积突变率为90.20%(184/204)，提示18、19和21外显子易受环境致癌物的攻击，突变后可能进一步激活EGFR信号转导通路，在NSCLC的发生、发展中可能起重要的作用。20外显子突变率为9.80%(20/204)，突变后可能改变了酪氨酸激酶区ATP结合囊的构象，从而增强了ATP与EGFR的亲和性，使肿瘤细胞对EGFR-TKIs产生抵抗性，这一突变主要见于EGFR-TKIs治疗后复发者［16-20］。

Ras基因家族成员包括H-Ras、N-Ras和K-Ras 3种亚型，与肿瘤的发生发展关系密切［21］，其中KRas基因与人类肿瘤的发生发展关系最为密切。KRas基因异常主要为点突变和基因扩增，由于第4外显子的拼接方式不同，更易发生突变［22］。K-Ras基因点突变以第2号外显子11、12、13、59和61密码子多见，其中96%发生在第2号外显子12、13密码子。这些密码子编码的氨基酸是K-Ras蛋白与GTP酶活化蛋白(GAP)作用位点。正常情况下，KRas蛋白通过GDP/GTP之间的转换来实现下游信号通路的调控。而突变的K-Ras蛋白不依赖上级信号的刺激，处于与GTP持续结合状态，导致下游的信号通路异常活跃，从而促进细胞的生长与增殖［23］。本研究显示，K-Ras基因的总突变率为2.00%(11/550)，与 Sun 等［24］研究(1.90%)接近。12密码子突变占总突变的90.91%(10/11)，其中G12C点突变占总突变的27.27%(3/11)，G12D点突变占总突变的18.18%(2/11)，G12V点突变占总突变的 36.36%(4/11)，G12S点突变占总突变9.09%(1/11)，此次未见G12A和G12R点突变;13密码子突变占总突变的9.09%(1/11)，为G13D点突变，此次未检测到G13C点突变;本次检测未见到K-Ras基因61密码子Q61H、Q61L和Q61R点突变。

BRAF基因与ARAF、RAF1同属于RAF基因家族，作为RAF-MEK-ERK信号转导通路中的重要成员，介导RAS与MAPK相结合，调节肿瘤细胞增殖、分化和凋亡。BRAF蛋白与K-Ras蛋白同为RAFMEK-ERK信号通路中上游调节因子，在 MAPK/ERK信号通路中起着举足轻重的作用;BRAF基因突变可通过两种途径致病，一是因遗传而导致先天性缺陷的途径，二是后天获得致癌基因而导致肿瘤的途径。有研究报道BRAF基因突变在NSCLC中突变率为1% ～3%［25］。本研究显示BRAF基因的总突变率为0.36%(2/550)，低于文献报道，突变类型均为V600E点突变，未见V600D和V600R点突变。

总之，NSCLC患者中EGFR基因存在较高的突变率，尤其为19和21外显子突变，其基因突变分型能指导EGFR-TKI的肿瘤靶向治疗，K-Ras和BRAF基因突变率虽低但不容忽视。

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