内质网应激和氧化应激在纳米氧化铈所致肺损伤中的作用

杨 静，吴 刚，李园园，吕丽萍，刘 扬，庞一强

（1.包头医学院基础医学与法医学院，内蒙古包头014040；2.鄂尔多斯市卫生学校，内蒙古鄂尔多斯017000；3.包头医学院研究生学院，内蒙古包头014040；4.包头市第四医院神经外科，内蒙古包头014030）

纳米氧化铈（CeO2）具有优异的抛光、催化、紫外吸收和离子导电等特性，因而广泛地应用于微电路抛光、空气净化以及固体氧化物燃料电池等众多领域［1］。随着纳米CeO2广泛的应用，其暴露人群和暴露量必将日趋增加。有研究显示纳米氧化铈暴露可导致肺组织炎症反应，气血屏障损伤，长期暴露最终导致肺纤维化，但具体机制尚不明确。有研究表明氧化应激参与了肺纤维化的发生与发展［2］；而内质网应激在多种肺部疾病的发生发展中发挥了重要的作用［3］。本研究拟用不同剂量纳米氧化铈进行气管滴注染毒，观察各组大鼠肺组织中内质网应激标志性蛋白GRP78和氧化应激指标SOD及MDA的变化，对纳米氧化铈所致肺损伤的可能机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠27只，体重220g～300g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.1.2 仪器及试剂 纳米CeO2（35nm±3nm），杭州万景新材料有限公司产品（质量分数≥99.9%）。兔抗大鼠GRP78单克隆抗体，北京博奥森公司产品；山羊抗兔IgG、免疫组织化学SP试剂盒、DAB显色剂，福州迈新产品；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒，丙二醛（MDA）试剂盒，南京建成公司产品。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及取材 购进大鼠后先进行适应性饲养，普饲，自由饮水。1周后，27只大鼠随机分为高剂量组（400mg／kg）、低剂量组（100mg／kg）和对照组，每组9只。染毒组大鼠以30g／L戊巴比妥钠麻醉后，采用非暴露式气管滴注染毒（纳米氧化铈颗粒用生理盐水配成悬浮液后高温消毒并进行超声分散），滴注量为2mL／kg，对照组注入等体积的生理盐水。染毒第28天时，30g／L戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，促凝管腹主动脉取血，并取部分肺叶并用100g／L中性甲醛固定，用于后续试验。

1.2.2 血清SOD活力，MDA含量检测 促凝管收集的血液常温下放置3h后以3 000r／min转速离心10min后取上层血清，应用黄嘌呤氧化酶法（羟胺法）测定SOD活力，硫代巴比妥酸法测定MDA［4］，具体步骤按照试剂盒说明书方法进行。

1.2.3 病理学观察 经100g／L甲醛溶液固定超过48h的肺组织，常规脱水，石蜡包埋、切片，苏木精-伊红（HE）染色，光学显微镜下观察病理学改变，包埋好的蜡块同时用于后期免疫组化。

1.2.4 免疫组化法检测肺组织GRP78蛋白表达按照文献［5］方法进行免疫组化操作组织切片，常规脱蜡、水化，加入枸橼酸盐缓冲液于微波炉内进行抗原修复，30mL／L双氧水封闭，滴加1∶200稀释的GRP78一抗4℃过夜，PBS冲洗3次，加入生物素标记的羊抗兔IgG抗体室温孵育15min，PBS冲洗3次，DAB显色。苏木素轻度复染，10mL／L盐酸-酒精中分化数秒，氨水反蓝数秒，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.2.5 结果分析 由病理科医师协助进行结果判断：以北京博奥森生物技术有限公司提供的阳性切片作为阳性对照，以0.01mol／L PBS液替代一抗作为阴性对照。结果判断：胞质中出现棕黄（褐）色颗粒者为阳性细胞，GRP78的阳性表达指数以染色强度分数×染色细胞比例分数表示。染色强度按颜色评分：完全阴性记0分，黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；染色细胞比例按阳性细胞百分比评分：＜5%、5%～24%、25%～49%、50%～74%、≥75%分别评为0、1、2、3、4分。

1.2.6 统计学处理 所有统计数据应用SPSS 19.0软件进行处理，试验数据均以±SD表示，多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析，若方差齐，各组之间均数的比较采用LSD-t检验；若方差不齐，采用Games-Howell检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠血清SOD活性和MDA含量

结果见表1。由表1可见，与对照组相比，不同浓度纳米CeO2颗粒染毒后大鼠血清SOD活力与MDA含量均降低。

2.2 肺组织病理学变化

肉眼观察：对照组大鼠肺组织颜色为粉红色，触之较为柔软，弹性高；染毒组大鼠肺组织颜色较暗，呈灰白色，弹性较差，部分肺组织表面可见白色结节，触之硬，剖检时有明显的颗粒感，肺组织表面有明显的结节。

光学显微镜观察：对照组大鼠肺组织固有结构完整，无破坏，肺泡腔内未见明显炎性细胞浸润及纤维组织增生；肺泡隔光滑，未见增宽（图1A）。染毒组：大量CeO2颗粒沉积，且面积较大，肺泡间隔明显增厚，肺泡腔内可见大量炎性细胞浸润，管壁严重充血，大部分肺组织纤维化，形成肺实变，并有异物肉芽肿形成，如图中箭头所示（图1B）。

表1 不同浓度纳米CeO2颗粒染毒后大鼠血清SOD活力和MDA含量Table 1 The seral levels of SOD and MDA in rats treated with different concentrations of nano CeO2

2.3 肺组织GRP78表达情况

GRP78蛋白主要位于细胞质，镜下染色呈棕黄（褐）色，如图2箭头所示。3组肺组织GRP78蛋白的阳性表达指数分别为：对照组1.40±0.84，400mg／kg染毒组6.90±1.45，100mg／kg染毒组4.00±1.15。不同剂量染毒组与对照组比较，差异显著（P＜0.05）。

图1 不同浓度纳米CeO2颗粒作用肺组织病理变化（HE，400×）Fig.1 Pulmonary histopathologyical lesions in rats treated with different concentrations of nano CeO2（HE，400×）

图2 免疫组化法检测不同浓度纳米CeO2颗粒作用肺组织GRP78表达（SP，400×）Fig.2 Expression of GRP78in lung of rats treated with different concentrations of nano CeO2detected by immunohistochemistry（SP，400×）

3 讨论

氧化应激［6］是指机体内高活性物质如ROS（reactive oxygen species）产生过多，超出了机体的清除能力，导致氧化／抗氧化失衡的一种状态。ROS又称反应性氧类物质，包括超氧阴离子（·O2-）、羟自由基（-OH·）和过氧化氢（H2O2）等，可以由细胞（如吞噬细胞、上皮细胞、中性粒细胞等）的正常代谢产生；也可以由外源因素诱导产生（如吸烟、辐射、粉尘等）。有研究表明［7-10］，很多纳米材料如纳米氧化锌、纳米二氧化钛、纳米二氧化硅、纳米氧化铝等可以通过氧化应激作用导致DNA受损，细胞死亡和组织损伤。而本研究发现纳米氧化铈经肺染毒大鼠后血清MDA和SOD无明显改变，说明从血清学指标观察其所致的肺损伤可能与氧化应激的关系不大，还需进一步研究。

内质网是真核细胞中十分重要的细胞器，具有折叠、翻译蛋白及维持细胞内钙稳态等生理作用。内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）可由包括缺血（氧）、营养物质（如氨基酸、葡萄糖等）缺乏及Ca2＋-ATP 酶抑制剂等多种因素诱导发生［11］。而GRP78作为ERS早期活化的标志性基因备受关注［12-13］。研究发现通过使用非暴露式气管滴注染毒法将35nm±3nm纳米氧化铈以不同剂量作用大鼠肺组织，不仅引起大鼠肺损伤，还使GRP78的表达水平增高，说明了内质网应激参与了纳米氧化铈颗粒所致肺损伤。导致发生内质网应激的原因可能是由于纳米氧化铈颗粒引起的物理损伤引起的［14］，纳米氧化铈颗粒作为不可生物降解的微粒属于非法外源物进入生物体，不能被合法转运或参与代谢。因此，它在体内作为物理粒子与机体发生相互作用，大量的纳米氧化铈颗粒聚集堵塞微循环、导致肺组织缺血缺氧，营养物质缺乏，或者破坏性穿越细胞膜及嵌入生物大分子空穴等引起生物结构破坏，进而引发肺组织发生内质网应激，进而产生进一步损伤和功能异常。

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