ROS对子宫内膜崩解的作用

刘书言，武 斌，陈西华，贺 斌，王树芳，，刘建兵，，徐祥波＊，王介东

（1.广西医科大学，广西南宁530021；2.山东大学附属济南市中心医院，山东济南250000；3.国家人口计生委科学技术研究所，北京100081；4.北京协和医学院研究生院，北京100730）

子宫内膜在每一个月经周期中发生着快速的崩解和脱落，这也是灵长类动物独特的生理现象。孕酮撤退是子宫内膜崩解脱落的始动因素，但其下游的信号通路仍未阐述清楚。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）在女性生殖系统的生理过程具有重要的作用。细胞内的ROS有3种主要的类型，即超氧离子（·O2-）、过氧化氢（H2O2）和氢氧离子（OH）［1］。许多研究显示，生理水平的ROS在女性生殖的生理过程，例如排卵、卵子成熟、黄体的活性、胚胎着床以及母胎的发育过程中，通过不同的信号传导途径而发挥至关重要的作用［2-4］。

在人的月经周期的分泌晚期，总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、Cu-SOD 和 Mn-SOD 的表达显著降低，而脂质体过氧化物的表达则显著增加［5］。这些结果提示生理水平的ROS在月经的调节方面可能起着重要的作用。ROS来源于炎症细胞例如巨噬细胞和中性粒细胞［6］，有报导显示，这些细胞在月经发生前大量浸润到子宫内膜中而影响子宫内膜的崩解和修复［7］。

月经机制的研究在一定程度上受限于缺少合适的动物模型，而人活体干预操作也会受限。小鼠月经样模型在一定程度上避免了这样的限制。小鼠生理性孕酮撤退月经模型首次于1984年建立［8］，且在30年后被澳大利亚的研究小组优化［9］。本研究小组利用药物米非司酮，在孕酮受体水平拮抗孕酮的作用，建立了小鼠药理性孕酮撤退月经模型［10］，小鼠生理性和药理性孕酮撤退月经样模型的建立为月经机制的研究提供了有价值的技术平台。在本研究中，我们发现生理水平的ROS在小鼠月经样模型中对子宫内膜的崩解具有重要作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雌性C57小鼠（8周龄～12周龄），购自中国医学科学院实验动物中心。小鼠在可控的条件下饲养（光照从6：00到18：00；温度21°C±1°C），并给予充足的饮水和食物。所有试验和手术步骤都由国家人口计划生育委员会科学技术研究所动物伦理委员会同意。

1.1.2 药品 内雌二醇（E2），Alfa Aesar Inc公司产品；孕酮（P4），Sigma-Aldrich Inc公司产品；花生油，山东鲁花公司；组织超氧阴离子色度法定量测定试剂盒，美国 Gen Med Scientifics Inc公司产品；N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC），Sigma-Aldrich公司产品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠月经样模型的建立 小鼠月经样模型的建立根据以往的研究报导进行［9］。具体方法如下：小鼠在麻醉下行双侧卵巢切除，恢复2周以清除体内E2和P4，然后进行以下操作：去势小鼠在第1、2、3天的9：30皮下注射E20.37nmol；在第4～6天不做处理；在第7天的9：30，皮下注射 P40.16 nmol和E20.02nmol，并将P4硅胶管埋植于小鼠背部皮下；在第8、9天的9：30分别皮下注射E2 0.02nmol，在第9天的11：30，将20μL花生油注射双侧子宫角以诱导蜕膜化。49h后（即在第11天的11：30）去除P4皮埋管（记为P4撤退0h），所有的处理组小鼠和对照组小鼠在P4撤退的0、8、12、16、24h（n＝15-20只／时间点）处死，收集子宫以进行组织形态和ROS含量的检测。

1.2.2 ROS含量的检测 子宫中ROS的检测使用以氮蓝四唑（NBT）染色的组织超氧阴离子色度法定量测定试剂盒。称取100mg冰冻子宫组织，洗涤缓冲液清洗1次，并用虹膜剪将组织样本剪成小块；加入500μL裂解液，旋涡振荡5s，冰上匀浆样品；BCA法测定匀浆液蛋白浓度；转移50μL的匀浆物（测试孔）和稀释液（空白）到96孔板中；每孔分别加入50μL的染色液，并轻轻混合；37℃孵育30min，用酶标仪测定580nm处吸光度，根据以下公式计算样本浓度：ROS（μmol·L／mg）＝［（ΔA）（0.1）（Df）／［（20）（0.05）］／C 其中 ΔA ＝ A（测试组）-A（空白）；0.1为体系容量；Df样品稀释倍数；20为NBT反应产物在580nm处的摩尔吸光系数；0.05为样本的体积；C为样本的蛋白浓度。

1.2.3 抗氧化剂NAC干预小鼠月经样模型 小鼠模型按照上述方法建立，小鼠在第11天11：30（孕酮撤退的1h）分别以不同剂量的NAC（200、350、500mg／kg溶于无菌的PBS）腹腔注射小鼠。随后去除孕酮皮埋管，且NAC分别在孕酮撤退的3、7、11h进行干预，对P4撤退的0、8、16、24h行阴道细胞学涂片检查，在不同时间点收集子宫用于组织形态学分析。

2 结果

2.1 小鼠月经样模型的建立

在小鼠月经样模型中，在孕酮撤退的0h到24 h子宫内膜经历了局部坏死到子宫内膜完全崩解的过程。在0h，子宫内膜基质细胞蜕膜化充分且完好（图1A）。在8h，子宫内膜基质细胞蜕膜化进一步发展，腔上皮下的基质细胞出现局部坏死现象（图1B）。在12h和16h，坏死的基质细胞增加，且面积进一步扩大（图1C，D）。在24h，蜕膜化的基质细胞完全坏死且整个坏死的蜕膜化区域从基底层脱落至宫腔（图1E）。阴道细胞学涂片显示，在24h，大量红细胞存在，提示子宫出血（图1F）。

2.2 小鼠月经样模型ROS的含量

对ROS在小鼠月经样模型子宫内膜崩解过程中的含量进行检测。在孕酮撤退的0h（孕酮撤退之前）和8h，ROS的含量很低，在12h的含量显著增加，在16h即子宫内膜崩解的早期达到最大值，在24h，ROS的含量显著降低。ROS在12h～24h与0h相比，其含量显著增加（P＜0.05），ROS在崩解期（特别是16h～24h）含量的增加，提示生理水平的ROS对月经发生的过程至关重要（图2）。

图1 孕酮撤退的24h子宫内膜崩解状况和阴道细胞学涂片Fig.1 The status of endometrial breakdown and vaginal smear at 24hafter P4withdrawal

图2 孕酮撤退的0h～24h子宫中ROS的含量Fig.2 The levels of ROS in the uterus from 0hto 24hafter P4withdrawal

2.3 ROS拮抗剂NAC处理对子宫内膜崩解的影响

在200mg／kg NAC处理组中，阴道细胞学涂片显示，在16h和24h的小鼠子宫出血百分比分别是88.9%和100%，与对照组出血阳性小鼠百分率相同（88.9% 和 100%）。在 350mg／kg 和 500mg／kg NAC处理组中，阴道细胞学涂片显示，在16h和24h的小鼠子宫出血率分别为22.2%以及14.3%和28.6%。红细胞数目评估显示350mg／kg和500 mg／kg NAC均减少了小鼠子宫出血程度（表1）。

在200mg／kg NAC处理组中，子宫大体呈现暗红色（图3A），提示子宫在此处理组出现出血现象。组织形态学显示，中间蜕膜化的子宫基质细胞完全坏死并脱落至宫腔（图3B、C）。对照组子宫也同样呈现暗红色（图3D），提示子宫出血，组织形态学显示子宫内膜同样出现崩解现象（图3E、F）。这些结果显示，200mg／kg NAC并没有抑制子宫内膜的崩解和脱落。在350mg／kg和500mg／kg NAC处理组中，子宫呈现淡粉色（图3G、J），提示子宫蜕膜化后并未出现出血现象。组织形态学结果显示，在这两个浓度的NAC处理中，子宫内膜基质细胞蜕膜化充分，且大部分细胞状态良好，仅有腔上皮下少数的基质细胞出现坏死现象（图3H、I、K、L）。

表1 不同剂量NAC对小鼠阴道出血程度的比较Table 1 The comparison of the effect of different dose of NAC on the vaginal bleeding

图3 不同剂量NAC（200mg／kg、350mg／kg和500mg／kg）对孕酮撤退24h的子宫大体和组织形态学的影响Fig.3 Effects of various NAC doses（200mg／kg，350mg／kg and 500mg／kg）on the endometrial breakdown at 24hafter P4withdrawal

3 讨论

在本研究中，我们从阴道细胞学涂片、子宫大体和组织形态学结果显示，生理水平的ROS对子宫内膜的崩解至关重要。据我们所知，这是ROS在月经发生中作用的首次报道。

在我们的研究中，应用NAC来研究ROS在月经发生中的作用。NAC通过抗氧化或者消除氧化自由基以增加细胞内GSH的含量（清除ROS酶的底物），因此，NAC被认为是重要的抗氧化剂，并被广泛用于研究ROS在不同生理和病理过程中的作用［9］。

在本研究中，24h的阴道涂片、子宫大体和组织形态学3个方面显示，在24h，NAC完全抑制小鼠月经样模型中子宫内膜的崩解。实际上，在腔上皮下有少量的坏死，这是局部坏死的表型，而与子宫内膜的崩解关系不大［9］。这些结果显示，ROS是子宫内膜崩解的关键因素之一。孕酮撤退是月经发生的起始触发因素，本研究结果显示，ROS是孕酮撤退下游信号通路。事实上，ROS在月经发生中的作用已有既往提示性报导。在人的月经周期中，从增殖期到中泌期，总SOD、Cu、Zn-SOD和 Mn-SOD在子宫内膜中的表达增加，而在分泌晚期的表达降低，与此同时，脂质过氧化物的含量增加。因此，提示ROS对月经的发生起作用［5］。在本研究中，生理水平的ROS从孕酮撤退的12h到24h显著增加，特别是在子宫内膜崩解前的12h到16h显著增加，这相当于人的分泌晚期，因此，ROS在小鼠月经样模型中的作用也极有可能出现在人月经中。

一般来说，好氧系统产生的ROS被认为对细胞有毒性作用。然而最近的研究显示，氧自由基介导了生物的一系列重要的生理事件［11-12］。目前，生理水平的ROS在女性的生理过程例如排卵和黄体功能具有重要的调控作用［13-14］。本研究清晰的阐述了ROS在月经发生中的作用，因此ROS对生理和病理过程均有重要作用。

综上所述，ROS是子宫内膜崩解的关键因素之一。本研究不但有助于理解月经复杂的生理机制，而且有助于临床异常出血的治疗。另外，抗氧化剂可能有干扰正常月经周期的潜在副反应，应该值得注意。

［1］Halliwell B，Gutteridge J M，Cross C E.Free radicals，antioxidants，and human disease：where are we now？［J］.J Lab Clin Med，1992，119（6）：598-620.

［2］Behrman H R，Kodaman P H，Preston S L，et al.Oxidative stress and the ovary ［J］.J Soc Gynecol Invest，2001，8（S）：S40-S42.

［3］Sabatini L，Wilson C，Lower A，et al.Superoxide dismutase activity in human follicular fluid after controlled ovarian hyperstimulation in women undergoinginvitrofertilization［J］.Fertil Steril，1999，72（6）：1027-1034.

［4］Ishikawa M.Oxygen radicals-superoxide dismutase system and reproduction medicine ［J］.Nihon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi，1993，45（8）：842-848.

［5］Sugino N，Shimamura K，Takiguchi S，et al.Changes in activity of superoxide dismutase in the human endometrium throughout the menstrual cycle and in early pregnancy［J］.Hum Reprod，1996，11（5）：1073-1078.

［6］Bryan N，Ahswin H，Smart N，et al.Reactive oxygen species ROSa family of fate deciding molecules pivotal in constructive inflammation and wound healing ［J］.Eur Cell Mater，2012，24：249-265.

［7］Evans J，Salamonsen L A.Inflammation，leukocytes and menstruation［J］.Rev Endocr Metab Disord，2012，13（4）：277-288.

［8］Finn C A，Pope M.Vascular and cellular changes in the decidualized endometrium of the ovariectomized mouse following cessation of hormone treatment：apossible model for menstruation［J］.J Endocrinol，1984，100（3）：295-300.

［9］Brasted M，White C A，Kennedy T G，et al.Mimicking the events of menstruation in the murine uterus［J］.Biol Reprod，2003，69（4）：1273-1280.

［10］Xu X B，He B，Wang J D.Menstrual-like changes in mice are provoked through the pharmacologic withdrawal of progesterone using mifepristone following induction of decidualization［J］.Hum Reprod，2007，22（12）：3184-3191.

［11］Agarwal A，Gupta S，Sharma R K.Role of oxidative stress in female reproduction［J］.Reprod Biol Endocrinol，2005，3：28.

［12］Nagy I Z.On the true role of oxygen free radicals in the living state，aging，and degenerative disorders［J］.Ann N Y Acad Sci，2001，928：187-199.

［13］Shkolnik K，Tadmor A，Ben-Dor S，et al.Reactive oxygen species are indispensable in ovulation［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108（4）：1462-1467.

［14］Kato H，Sugino N，Takiguchi S，et al.Roles of reactive oxygen species in the regulation of luteal function ［J］.Rev Reprod，1997，2（2）：81-83.