温和气单胞菌毒力基因的检测及其对鲫鱼致病性试验

王海娟，王 利

（1.西南民族大学青藏高原研究院，四川成都610041；2.西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041）

温和气单胞菌（Aeromonassobria）属弧菌科、气单胞菌属，是一种人、鱼和其他动物共患的条件性致病菌，可引起人类患细菌性腹膜炎、菌血症、软组织坏死、急性肠胃炎、阑尾炎、坏死性筋膜炎等疾病［1-3］，同时也可感染多种鱼类。目前已从鲈鱼、日本鳗鲡、罗非鱼、中华鳖［4］、黄颡鱼等分离鉴定出该菌。温和气单胞菌致病株的毒力与其产生的溶血素、肠毒素、细胞毒素及胞外酶等多种重要的致病因子有关。当条件适宜时，该菌生长迅速，繁殖较快，其产生的毒素可引起机体复杂多样的病理变化。

鲫鱼（Cruciancarp）是我国水产养殖中最常见淡水鱼类。近年来，随着水体恶化、养殖集约化等现象，细菌性疾病屡次发生，对鲫鱼及整个水产养殖业造成了严重的经济损失，对人类的健康构成了潜在的威胁。弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacterfreundii）［5］、迟钝爱德华菌（Edwardsiellatarda）、沙门菌（Salmonella）等相继从发病鲫鱼体内分离出，但尚未见温和气单胞菌对鲫鱼致病性研究的报道。本试验采用PCR方法对温和气单胞菌菌株A.S1进行毒力基因检测，同时人工回归感染鲫鱼，旨在为进一步研究温和气单胞菌在鱼类中的致病机制提供科学资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株 温和气单胞菌菌株A.S1由本校动物遗传育种学国家民委-教育部重点实验室低温保存备用。

1.1.2 主要试剂及仪器 普通营养琼脂，杭州微生物试剂有限公司产品；DNA Marker D L 2 000，宝生物工程（大连）有限公司产品；细菌基因组DNA提取试剂盒和2×TaqPCR MasterMix，天根生化科技（北京）有限公司产品；PCR仪，Eppendorf公司产品；凝胶成像系统，Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 制备DNA模板 将超低温保存的温和气单胞菌菌株快速复苏，接种于LB液体培养基，28℃培养过夜，简短离心，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌的总DNA，置-20℃保存备用。

1.2.2 引物设计 根据GenBank数据库中的毒力基因序列，利用Primer 5.0软件设计温和气单胞菌4种主要毒力因子溶血素基因（hly）、细胞兴奋性肠毒素基因（alt）、黏附素基因（aha1）和气溶素基因（aerA）的引物。引物序列见表1，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.3 毒力基因扩增 采用PCR方法对4种主要毒力基因进行扩增，反应体系（20μL）：ddH2O 7.4μL，上、下游引物各 0.8μL（引物浓度均为10μmol／L），2×TaqMix 10μL，DNA 模板1μL。PCR反应程序：94℃3min；94℃30s，53s～60s（退火温度见表1），72℃60s，35个循环；最后72℃10min。取PCR产物5μL进行10g／L琼脂糖凝胶电泳检测，并在凝胶成像系统下拍照。

表1 温和气单胞菌毒力基因的引物序列Table 1 Primer sequences of virulence genes of Aeromonas sobria

1.2.4 动物回归试验 将复苏后的温和气单胞菌于LB液体培养基中，28℃、180r／min培养过夜，简短离心，除去上层多余液体培养基。参考麦氏比浊法，用7.5g／L的灭菌生理盐水将该菌配置成浓度为1.5×108CFU／mL的菌悬液。将20条健康的鲫鱼分为对照组和试验组，每组分配10条，体长15cm～17cm，体重120g～150g。对照组每尾鲫鱼注射0.3mL的无菌生理盐水，试验组的每尾鲫鱼腹腔注射等体积的菌悬液。每日观察试验组鲫鱼的症状并记录死亡情况，连续观察1周。及时对死亡鲫鱼进行剖检，无菌条件下将其心、肝、脾等组织划线接种于营养琼脂培养基。应用传统的细菌鉴定方法和扩增16SrDNA基因方法鉴定再次分离到的细菌。

2 结果

2.1 毒力基因检测结果

温和气单胞菌的4种主要毒力基因扩增产物经电泳检测结果如图1所示，该菌株中扩增到hly、alt和aha1 3种毒力基因，扩增片段的长度分别为1 470、480、1 087bp，与预期片段长度基本相符。未扩增出aerA基因。

2.2 动物回归试验

将健康鲫鱼腹腔注射温和气单胞菌菌悬液后，均在2d～5d发病死亡。发病鲫鱼初期表现为行动缓慢，对外界刺激反应迟钝，眼周、下颌及鳍条基部轻微出血，鳃盖周围点状出血。严重时鱼体在水中失去平衡，体表大面积出血，且胸鳍、腹鳍和臀鳍出血加重，腹部肿大。解剖后发现，部分鱼体腹腔有腹水，肠道充盈，肝脏质地较脆，脾脏暗红色。对照组的鲫鱼在试验期间无发病及死亡情况。从人工回归感染温和气单胞菌后的濒死鲫鱼的脾、肝和心组织中分离到形态与自然感染菌株一样的细菌，该菌的16SrDNA基因比对结果显示为温和气单胞菌。

图1 菌株A.S1的毒力基因PCR扩增产物Fig.1 PCR amplification of virulence genes of strain A.S1

3 讨论

3.1 毒力基因的检测

气单胞菌的致病机制是复杂的，是由多种毒力因子如肠毒素、溶血素、鞭毛A和B（fla）、脂肪酶（lip）、弹性蛋白酶（ela）、丝氨酸蛋白酶（ser）、ADP-转移酶毒素（aexT）等相互作用的结果。检测气单胞菌属的毒力基因对确定病原体潜在的致病性和后续可能的感染病原体的预防是至关重要的。

温和气单胞菌的溶血素对哺乳动物细胞都具有细胞毒性和肠毒性。溶血素肠毒性作用的机制是可刺激培养的动物细胞产生环腺苷酸。研究表明，温和气单胞菌的hly基因与嗜水气单胞菌的气溶素基因在氨基末端区域的序列是同源的，但在羧基端没有同源性。程方俊等［6］从温和气单胞菌RC-07-KA菌株克隆扩增出hly基因，并构建了重组溶血素及检测其活性。hly基因已从人源温和气单胞菌检测到，本研究从鱼源菌株A.S1中也检测到了hly基因，这说明溶血素基因在多种不同来源的温和气单胞菌中存在。肠毒素包括细胞兴奋性肠毒素、细胞毒肠毒素和细胞溶解性肠毒素。肠毒素前体是由488个氨基酸残基合成，成熟的肠毒素其氨基末端的24个氨基酸残基前体被移除。这些与抗原性相关的毒素被认为在诱发机体腹泻中起着关键作用。细胞兴奋性肠毒素可引起小鼠肠道液体的积累，但不会造成细胞损伤［7］。另外，温和气单胞菌肠毒素可使中国仓鼠卵巢细胞（CHO）诱导细胞内乳糖脱氢酶（LDH）的释放，当增加葡聚糖时可抑制LDH的释放和毒素对红细胞的溶解作用。毒素可在红细胞膜上形成膜孔，进而形成渗透梯度造成红细胞损伤。这与嗜水气单胞菌的肠毒素致病机制很类似。Pablos M等［8］从分离自腹泻患者和饮用水的800株气单胞菌中，检出毒力基因alt、hlyA、aerA、ast、laf携带率分别为 71.9%、28.1%、25.0%、18.8% 和9.4%。本研究中检测到alt基因，这说明alt基因广泛存在气单胞菌属中。

关于黏附素基因（aha1）报道的较少，在5株黄沙鳖源嗜水气单胞菌中，毒力基因hly、aerA和act的检测率为100%，ahal、alt和ahp 为80%［9］。13株致病性气单胞菌中10株细菌同时携带毒力基因alt，ahal和aerA［10］。本试验菌株 A.S1中检测出ahal基因。气溶素aerA的致病机制是，其成熟蛋白可与宿主细胞表面的特异性糖蛋白受体相结合，植入脂质双分子层，形成膜孔，破坏细胞的通透性，导致宿主细胞死亡。研究发现，86株意大利气单胞菌菌株（30%嗜水气单胞菌、18.5%豚鼠气单胞菌、23.7%杀鲑气单胞菌）中83.7%菌株携带aerA基因［11］。109株墨西哥和西班牙人源气单胞菌菌株中，检测到携带aerA基因的菌株占89%［12］。本研究中没有检测到aerA基因，说明aerA毒力基因的分布是多样性的，在不同宿主、不同地域和不同菌株间是存在差异的。

3.2 致病性研究

温和气单胞菌在河水和海水中也可以产生毒素，这说明自然界的温和气单胞菌的毒素可能会通过水体，食物源等途径传递到人和动物体，从而导致人和动物体发病。关于温和气单胞菌的致病性已有部分研究。童桂香等［13］研究表明，温和气单胞菌对黄沙鳖具有较强的致病性，在人工感染30h后出现死亡。任红梅等［14］发现，黄鳝在感染温和气单胞菌3h左右，其内脏器官发生病变，12h～36h出现死亡高峰期。马有智等［15］将温和气单胞菌分别感染小鼠和中华鳖发现，小鼠在感染24h内全部死亡，健康鳖在感染6d～8d发病，17d出现死亡。本试验将温和气单胞菌感染鲫鱼后发现，健康鲫鱼在48h后出现发病症状，第3天出现死亡，这说明温和气单胞菌对鲫鱼具有较强的致病性。因此，在水产养殖过程中，应加强水质管理，同时采取积极的措施预防该病的发生。

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