牛皮蝇幼虫蛋白表达谱及一种高表达蛋白的分离纯化

付 伟，李鹏飞，娄亚南，金素钰，黄 林，林亚秋，郑玉才

（西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041）

牛皮蝇蛆病（Hypodermosis）是一种世界范围内存在的动物疾病，能感染家养和野生反刍动物，感染率很高［1-2］，其病原主要是双翅目、皮蝇科、皮蝇属的牛皮蝇（Hypodermabovis）和纹皮蝇（Hypoder-malineatum），而国内病原主要为中华皮蝇（Hypodermasinense），约占牦牛（Bosgrunniens，yak）感染率的90%［2］。由于牛皮蝇蛆病可严重影响畜牧业生产，国内外已经对该病开展了不少基础和防控方面的研究，包括流行病学分析 、牛皮蝇鉴定和分子生物学［2-5］及防控措施［6-7］。本课题组对牦牛皮下寄生的中华皮蝇幼虫乳酸脱氢酶进行了分离纯化，发现该酶为特殊的单体酶，结构较稳定，米氏常数与其他动物存在差异［8］。

为全面了解牛皮蝇幼虫的蛋白表达特征，本研究对感染牦牛的牛皮蝇二期或三期幼虫总蛋白进行电泳分析，阐明其蛋白表达谱的个体差异，同时利用双向电泳-质谱技术，试图鉴定一些差异表达蛋白，为牛皮蝇蛆病的诊断和防控提供新的线索。本研究还利用分子筛和离子交换层析，纯化了在牛皮蝇幼虫中一种高表达的蛋白质。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品的采集和鉴定 牛皮蝇二期或三期幼虫采自四川省青白江区某屠宰场，牦牛（n＝5）屠宰后从皮下采集幼虫（n＝53），经生理盐水清洗后用干冰带回实验室，置-80℃冻存。用Otranto D等［4-5］建立的PCR-RFLP方法，结合本实验室牦牛皮蝇幼虫快速鉴定方法对采集的牛皮蝇进行鉴定，结果显示，所有样品均为中华皮蝇（H.sinense）幼虫。

1.1.2 主要试剂和仪器 固相pH梯度胶条（pH3～10，非线性）、丙磺酸（CHAPS）、碘乙酰胺、Bio-Lyte 3／10、二硫苏糖醇（DTT）、十二烷基硫酸钠（SDS）、尿素，美国Bio-Rad公司产品；苯甲基磺酰氟（PMSF），美国Amresco公司产品；ProteanⅡxi cell垂直电泳槽、Protean IEF cell等电聚焦系统、Versa Doc 1000凝胶成像系统及 PDQuest Version 7.0.1软件，Bio-Rad公司产品；组织匀浆器，美国Wheaton公司产品；CR21G高速冷冻离心机，日本日立公司产品；Biowave紫外可见分光光度计，英国Biochrom公司产品。

1.2 方法

1.2.1 牛皮蝇幼虫总蛋白提取 牛皮蝇幼虫测量体长和称重后，加入10倍体积匀浆液（0.02mol／L Tris-HCl，pH 7.5；0.001mol／L PMSF），用电动匀浆器在冰上匀浆30s，10 000r／min于4℃离心20min，上清液分装并保存于-80℃，用Bradford法测蛋白质浓度。

1.2.2 牛皮蝇幼虫蛋白的电泳分离 取上述蛋白抽提液加入等体积的上样缓冲液，煮沸5min后，用分离胶浓度为125g／L的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，每孔上样6μg蛋白质。电泳条件为：60V电泳50min，然后120V电泳至指示剂接近凝胶底部。凝胶用1g／L考马斯亮蓝R-250染色50min，脱色后保存于70g／L冰乙酸中。

1.2.3 牛皮蝇幼虫中一种高表达蛋白的纯化 将包含一种高表达蛋白的牛皮蝇幼虫匀浆液混合（5mL），采用Superdex 75分子筛层析进行2次分离（第2次上样前洗脱样品须冻干浓缩），层析柱规格为1cm×20cm，洗脱液为0.02mol／L Tris-HCl（pH 7.5），在 AKTA prime低压层析仪上完成。洗脱液冻干浓缩后，上High Q阴离子交换层析（Bio-Rad预装柱），用含1mol／L NaCl的上述缓冲液进行梯度洗脱，收集洗脱峰并进行SDS-PAGE检测。

1.2.4 牛皮蝇幼虫蛋白的双向电泳分离 选取SDS-PAGE图谱差异极大的10号和14号牛皮蝇幼虫匀浆液进行双向电泳。采用固相pH梯度胶条（pH3～10，非线性）进行等电聚焦，每根胶条蛋白上样500μg，蛋白液和水化液共300μL（7mol／L尿素，2mol／L硫脲，40g／L CHAPS，65mmol／L二硫苏糖醇，2g／L Bio-lyte，0.01g／L溴酚蓝），上样方法为胶条20℃主动泡胀14h。聚焦条件为：恒温20℃下，250V3h（慢），500V1h（慢），1 000V1 h（慢），5 000V3h（快），10 000V6h。

等电聚焦结束后，胶条分别在平衡缓冲液Ⅰ（6mol／L尿素，20g／L SDS，0.375mol／L pH 8.8 Tris-HCl，200mL／L甘油，20g／L二硫苏糖醇）和平衡缓冲液Ⅱ（25g／L碘乙酰胺代替缓冲液Ⅰ中的20g／L二硫苏糖醇）中进行平衡，每次15min。用分离胶浓度为125g／L的SDS-PAGE进行第二向分离，电泳条件为：16mA／胶条30min，恒压200V电泳直至溴酚蓝指示剂接近凝胶底部。1g／L的考马斯亮蓝R-250染色，脱色后保存于70g／L冰乙酸中。

凝胶用Versa Doc 1000凝胶成像系统拍照获取图谱，再用PDQuest 7.1进行蛋白质斑点的检测、背景消减、匹配、强度比较等。用灭菌枪头将需要鉴定的蛋白点挖出，送深圳华大基因进行MALDI-TOF-TOF串联质谱鉴定。以双翅目中的果蝇（Drosophilamelanogaster）为搜索数据库，设置参数后用Mascot软件对获得的质谱数据进行搜索和鉴定。

2 结果

2.1 牛皮蝇幼虫总蛋白SDS-PAGE

牛皮蝇幼虫（n＝53）总蛋白在SDS-PAGE上能获得较好分离（图1），不同个体间蛋白表达谱存在不同程度差异，其中共有12个样品表现出含有一种高丰度蛋白（如图1中3、7、8泳道箭头位置），分子质量约为78ku。

图1 牛皮蝇幼虫蛋白抽提液SDS-PAGE图谱Fig.1 SDS-PAGE of protein extract of Hypodermalarvae

2.2 牛皮蝇幼虫中一种高表达蛋白的纯化

牛皮蝇幼虫匀浆液经离子交换和分子筛层析分离后，其中的一种分子质量约为78ku的高表达蛋白质获得了有效分离（如图2中9泳道箭头位置），电泳纯的蛋白质可用于进一步的分析、抗体制备等。

2.3 牛皮蝇幼虫蛋白的双向电泳分析

牛皮蝇幼虫10号和14号样品总蛋白的SDSPAGE图谱差异极大（图3A），进一步用双向电泳对其进行分离，获得了分辨率和重复性较好的电泳图谱（图3B、图3C）。软件分析显示，两个样品分别有312±24个和284±13个点得到分离。对其中的4个蛋白点（8、11、13、14）进行质谱分析，结果未得到分数高的匹配结果。

图2 牛皮蝇幼虫中一种高表达蛋白的纯化Fig.2 Purification of a high expression protein in Hypodermalarvae

图3 牛皮蝇幼虫总蛋白电泳图谱Fig.3 The electrophoretic profile of Hypodermalarva total protein

3 讨论

牛皮蝇蛆病一直是制约我国牦牛饲养业的主要疫病之一，其中又以中华皮蝇的危害最为严重。有研究表明，在藏区患皮蝇蛆病的牦牛中，大约有90%都是由于中华皮蝇的感染，而牛皮蝇和纹皮蝇感染率各只占约5%［2］。中华皮蝇不仅寄生于牦牛体内，同时也侵害人和藏羚羊等哺乳动物，极大地威胁着人和牲畜的健康［9-10］。

研究显示，机体不同发育时期，其蛋白质表达种类和数量存在差异［11-12］。本试验中牦牛皮蝇幼虫总蛋白经SDS-PAGE分析，发现不同个体蛋白质表达谱存在不同程度差异，但大多数个体的蛋白条带位置和数量相似，提示在牛皮蝇幼虫发育的二期或三期，其蛋白质表达量虽然存在明显差异，但种类可能差异不大。利用ELISA和 Western blot等技术检测牲畜体内特定蛋白，可用于牛皮蝇蛆病的早期检测和预防［13］。本试验利用Superdex 75分子筛层析并结合离子交换层析纯化了一种分子质量约为78ku的高表达蛋白，为探索该蛋白与牛皮蝇幼虫发育的关系和进一步研究牛皮蝇蛆病的感染、诊断及治疗提供了一定的线索。

基于双向电泳-质谱技术的蛋白质组学已应用于生物学、医学和农业科学等各个领域［14-16］，但有关牦牛皮蝇幼虫总蛋白的研究尚未见报道。本试验对总蛋白差异较大的两样品进行双向电泳，获得了分离效果较好的蛋白质图谱，但质谱鉴定并未得到分数较高的蛋白质，推测其原因可能与利用果蝇数据库搜索蛋白质信息有关，因为果蝇与牛皮蝇亲缘关系较远，蛋白质序列可能存在较大差异。本试验成功分离了牛皮蝇二期或三期幼虫总蛋白，为进一步研究其蛋白质组学奠定了基础。

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