香烟烟雾染毒对雄性大鼠睾丸组织ATP酶活性的影响

张静，仲春雪，黄云飞，张晨，何丽娟，邹莹

香烟烟雾染毒对雄性大鼠睾丸组织ATP酶活性的影响

张静，仲春雪，黄云飞，张晨△，何丽娟，邹莹

目的探讨香烟烟雾染毒对大鼠睾丸结构及睾丸组织ATP酶活性的影响。方法清洁级成年雄性SD大鼠70只，随机分为对照组（10只）和低、中、高剂量染毒组（每组20只，分别给予10支、20支、30支香烟烟雾暴露）。染毒组采用呼吸道静式染毒，每日1次，每次30 min，各剂量染毒组分别染毒6周和12周（每个时段10只大鼠）。实验期间记录各组大鼠体质量变化。实验结束后，摘取睾丸，HE染色观察睾丸组织结构，酶联免疫吸附试验检测睾丸组织Na＋-K＋-ATP酶、Ca2＋-ATP酶活性。结果随染毒剂量增加，各组大鼠体质量逐渐降低（P＜0.05）。染毒组大鼠睾丸病理切片观察到不同程度损伤，且随着染毒时间的延长和染毒剂量的增加，损伤逐渐加重。染毒6周后，高剂量组大鼠睾丸组织Na+-K+-ATP酶活性低于其他3组（P＜0.05），Ca2+-ATP酶活性低于对照组（P＜0.05）。染毒12周后，低、中、高剂量组大鼠睾丸组织Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性均较对照组显著降低（P＜0.05）。结论香烟烟雾染毒可减缓雄性大鼠生长，导致睾丸组织损伤，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性降低。

吸烟，烟草；烟雾；大鼠，Sprague-Dawley；睾丸；腺苷三磷酸酶类；钠钾交换ATP酶；钙转运ATP酶类

我国是世界上最大的烟草生产国和消费国，吸烟是我国目前面临的最突出的公共卫生问题之一。香烟烟雾是明确的细胞诱变剂和化学致癌物，对人体多种组织器官有害，同时也是导致疾病和过早死亡的危险因素［1-2］。研究发现，长期吸烟对生殖系统会产生不利影响［3-5］。本研究通过建立大鼠香烟烟雾暴露模型，检测香烟烟雾染毒对雄性大鼠睾丸ATP酶（ATPase）活性的影响，探讨其致生殖系统损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂清洁级成年雄性SD大鼠70只，体质量180～220 g，由新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心提供，动物许可证号：SCXK（新）2011-0001。某品牌过滤嘴香烟，烟气烟碱量1.2 mg/支，焦油量12 mg/支，新疆卷烟厂生产。超微量Na＋-K＋-ATP酶检测试剂盒、超微量Ca2＋-ATP酶检测试剂盒、考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 分组及染毒动物适应性喂养1周后按随机数字表法分为对照组（10只）和低、中、高剂量染毒组（每组20只，分别给予10支、20支、30支香烟烟雾暴露）。染毒组大鼠置于自制染毒箱内（80 cm×80 cm×60 cm），采用呼吸道静式染毒，香烟烟雾由真空泵抽入，每日1次，每次30 min，各剂量染毒组分别染毒6周和12周（每个时段10只大鼠）。对照组大鼠每日相同时间被放置于染毒箱内，但未进行染毒。实验期间观察动物的生长情况及体质量变化。

1.2.2 标本采集及处理实验结束后腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉动物，摘取双侧睾丸。右侧睾丸液氮固定，-80℃保存用于制备组织匀浆，左侧睾丸4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片（5 μm），常规HE染色，光镜观察。

1.2.3 睾丸组织匀浆的制备称取适量睾丸组织，按1∶9（W/V）比例加入生理盐水，机械匀浆后2 500 r/min离心10 min，所得上清液即为睾丸组织匀浆。生理盐水10倍稀释后考马斯亮蓝法测定各样品蛋白浓度。

1.2.4 超微量Na＋-K＋-ATP酶、Ca2＋-ATP酶活性测定取相同浓度的组织蛋白，按试剂盒操作步骤加样，混匀，室温静置5 min，于636 nm波长处，测定各管吸光度（A）值。按照试剂盒说明计算睾丸组织中Na＋-K＋-ATP和Ca2＋-ATP酶活性。

1.3 统计学方法采用SPSS 16.0软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，2组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用方差分析，组间多重比较采用LSD-t法，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 一般情况比较对照组大鼠饮食饮水正常，精神状态良好，活动敏捷，体质量增加明显；染毒组大鼠精神状态较差，倦怠懒动，出现不同程度饮食饮水量减少，高剂量染毒组大鼠染毒后期出现精神萎靡，进食差。

2.2 各组体质量比较经过不同染毒剂量及染毒时间后，大鼠体质量差异有统计学意义（P＜0.05），染毒剂量与染毒时间存在交互效应（P＜0.05）。染毒6周后，中、高剂量组大鼠体质量较对照组和低剂量组降低（P＜0.05）。染毒12周，随染毒剂量增加，大鼠体质量逐渐降低，差异有统计学意义（P＜0.05），各剂量组不同染毒时间体质量差异均有统计学意义（P＜0.05），这与大鼠处于生长期有关，见表1。

Tab.1Comparison of body weights of rats between four groups表1 各组大鼠体质量比较（n=10，g，）

Tab.1Comparison of body weights of rats between four groups表1 各组大鼠体质量比较（n=10，g，）

＊P＜0.05；F组间=29.090，F时间=274.757，F交互=9.167，均P＜0.05；组间比较：a与对照组比较，b与低剂量组比较，c与中剂量比较，P＜0.05；组内比较：A与染毒前比较，B与染毒6周比较，P＜0.05

染毒前238.4±16.2 244.8±17.6 242.2±21.2 243.7±31.7 0.133组别对照组低剂量组中剂量组高剂量组F染毒6周395.9±18.1A 380.0±7.2A 315.0±13.2Aab 281.3±25.1Aab 15.090＊染毒12周451.4±20.1AB 455.3±13.6AB 407.8±13.7ABab 348.3±7.2ABabc 11.649＊F 65.940＊146.043＊67.836＊35.310＊

2.3 大鼠睾丸组织病理变化对照组大鼠睾丸组织曲细精管形态规则，生精上皮基膜完整，各级生精细胞排列整齐，曲细精管内可见大量精子。染毒12周后，低剂量组大鼠睾丸组织局部界膜剥脱，曲细精管内生精细胞层数减少。中剂量组大鼠睾丸组织生精细胞排列疏松紊乱，细胞间隙明显。高剂量组大鼠睾丸组织仅见少量的支持细胞和精原细胞和精子细胞，未观察到游离精子，支持细胞出现空泡化，见图1。

2.4 睾丸组织Na+-K+-ATP酶活性变化不同染毒剂量及染毒时间大鼠睾丸组织匀浆中Na+-K+-ATP酶活性差异有统计学意义（均P＜0.05），染毒时间与染毒剂量间无交互效应（P＞0.05）。染毒6周后，高剂量组Na+-K+-ATP酶活性低于其他3组（P＜0.05）；染毒12周后，低、中、高剂量组Na+-K+-ATP酶活性较对照组均明显降低（P＜0.05），且中、高剂量与低剂量组比较均显著降低（P＜0.05）。低、中剂量组染毒12周时Na+-K+-ATP酶活性较染毒6周时降低（均P＜0.05）；高剂量组不同染毒时间大鼠睾丸组织匀浆中Na+-K+-ATP酶活性差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.5 睾丸组织Ca+-ATP酶活性变化经过不同剂量染毒后各组Ca2+-ATP酶活性差异有统计学意义（P＜0.05），而不同染毒时间后各组Ca2+-ATP酶活性差异无统计学意义（P＞0.05），暴露时间与暴露剂量间无交互效应（P＞0.05）。染毒6周后，高剂量组大鼠Ca2+-ATP酶活性与对照组比较显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；染毒12周后，低、中、高剂量组Ca2+-ATP酶活性较对照组均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。高、中、低剂量组不同染毒时间大鼠睾丸组织匀浆中Ca2+-ATP酶活性差异无统计学意义（均P＞0.05），见表3。

Fig.1Rat testis tissue morphology in each group(HE，×400)图1 各组大鼠睾丸组织形态（HE，×400）

Tab.2Comparison of Na+-K+-ATP enzyme activity in testes between four groups表2 各组大鼠睾丸组织Na+-K+-ATP酶活性比较（n=10，U/mg，）

Tab.2Comparison of Na+-K+-ATP enzyme activity in testes between four groups表2 各组大鼠睾丸组织Na+-K+-ATP酶活性比较（n=10，U/mg，）

＊P＜0.05；F组间=7.000，F时间=10.827，均P＜0.05，F交互=0.813，P＞0.05；a与对照组比较，b与低剂量组比较，c与中剂量组比较，P＜0.05；A与染毒6周比较，P＜0.05

组别对照组低剂量组中剂量组高剂量组F 6周1.38±0.18 1.31±0.14 1.22±0.15 0.66±0.16abc3.552＊12周1.38±0.18 0.94±0.10aA0.57±0.11abA0.41±0.12ab8.998＊t 4.612＊12.057＊1.662

Tab.3Comparison of Ca2+-ATP enzyme activity in testes between four groups表3 各组大鼠睾丸组织Ca2+-ATP酶活性比较（n=10，U/mg，）

Tab.3Comparison of Ca2+-ATP enzyme activity in testes between four groups表3 各组大鼠睾丸组织Ca2+-ATP酶活性比较（n=10，U/mg，）

＊P＜0.05；F组间=6.219，P＜0.05；F时间=1.637，F交互=0.104，均P＞0.05；a与对照组比较，P＜0.05

组别对照组低剂量组中剂量组高剂量组F 6周0.81±0.10 0.65±0.11 0.59±0.11 0.47±0.17a 3.601＊12周0.81±0.10 0.42±0.09a 0.44±0.12a 0.31±0.12a 6.281＊t 1.339 0.543 0.592

3 讨论

本研究发现，染毒组大鼠精神状态较差，倦怠懒动，出现不同程度饮食饮水量减少，体质量增长较缓慢，并且随着染毒剂量的增加表现更加明显。各组大鼠的初始体质量无显著差异，染毒12周后随染毒剂量增加，大鼠体质量逐渐降低，提示香烟烟雾染毒会对大鼠生长发育造成影响。

ATP酶在动物组织内广泛存在，在维持Na+、K+平衡和细胞内外压方面起重要作用，还可参与氨基酸、糖等物质的运输。睾丸间质细胞、支持细胞及生精细胞质膜和线粒体内膜上均有ATP酶存在，其中，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶是精子获能的关键酶，它们介导ATP的降解，为精子纤维收缩提供能量。Na+-K+-ATP酶可调节细胞内外Na+、K+浓度，在维持正常细胞内渗透压及膜电位方面起重要作用；而Ca2+-ATP酶主要参与调节细胞内外钙平衡。两者均参与细胞内外Mg2+、Ca2+、Na+、K+离子转运，以维持细胞膜结构完整及正常生理生化活动［6-8］。已有研究发现，体内自由基增多时，会破坏Na+-K+-ATP酶结构，使Na+-K+-ATP酶活性降低，导致细胞内Na+增多，从而激活细胞膜上的Na+-Ca2+交换，引起细胞内钙超载，Ca2+-ATP酶活性减弱，最终抑制线粒体氧化磷酸化反应，造成ATP合成减少，细胞能量耗竭［9-10］。

本研究病理结果显示，对照组大鼠睾丸组织曲细精管形态规则，各级生精细胞排列整齐，曲细精管内可见大量精子；而染毒组随着染毒时间的延长及染毒剂量的增加，睾丸出现不同程度的病理损伤,主要表现为睾丸组织局部界膜剥脱，生精细胞排列疏松紊乱，精子减少，支持细胞出现空泡化等。由此可见，香烟烟雾染毒可导致雄性大鼠睾丸组织损伤。

本研究ATP酶活性检测结果显示，染毒6周后，高剂量组大鼠睾丸组织匀浆中Na+-K+-ATP酶活性低于其他3组，Ca2+-ATP酶活性低于对照组。染毒12周后，低、中、高剂量组大鼠睾丸组织Na+-K+-ATP、Ca2+-ATP酶活性均较对照组显著降低，并且随着染毒剂量的增加，降低更加显著，呈现剂量反应关系。以上结果均提示香烟中的有害物质可导致大鼠睾丸组织中Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活性降低，从而抑制线粒体能量代谢功能，最终损害睾丸功能。

综上所述，香烟烟雾染毒可导致雄性大鼠生长发育减缓，睾丸组织损伤，Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活性降低，干扰雄性大鼠睾丸的能量代谢，导致其睾丸能量的产生和利用发生障碍，从而损害睾丸功能。

［1］Gururaj G，Girish N.Tobacco use amongst children in Karnataka［J］.Indian J Pediatr，2007，74（12）：1095-1098.

［2］Huxley RR，Woodward M.Cigarette smoking as a risk factor for coronary heart disease in women compared with men：a systematic review and meta-analysis of prospective cohort studies［J］.Lancet， 2011，378（97）：1297-1305.doi：10.1016/S0140-6736(11)60781-2.

［3］Taszarek-HG，Depa-Martynów M，Derwich K，et al.The influence of cigarette smoking on sperm quality of male smokers and nonsmokers in infertile couples［J］.Przegl Lek，2005，62（10）：978-981.

［4］Liang HP，Han SZ，Ping F.Development on relationship of smoking and multiple organ damage［J］.Int J Respir，2015，35（11）：878-880.［梁会朋，韩书芝，平芬.吸烟与多脏器损害研究进展［J］.国际呼吸杂志，2015，35（11）：878-880］.doi：10.3760/cma.j. issn.1673-436X.2015.11.019.

［5］Jana K，Samanta PK，De DK.Nicotine diminishes testicular gametogenesis，steroidogenesis，and steroidogenic acute regulatory protein expression in adult albino rats：possible influence on pituitary gonadotropins and alteration of testicular antioxidant status［J］.Toxicol Sci，2010，116（2）：647-659.doi：10.1093/toxsci/ kfq149.

［6］Vivens CY，Peralta-Arias RD，Camejo MI，et al.Biochemical identification of dynein-ATPase activity in hunman sperm［J］.Z Naturforsch C，2009，64（9/10）：747-753.

［7］Mu HL，Zhang QJ，Yang CL，et al.Effect of high power microwave radiation on oxidative stress and ATPase activity of testis in mice［J］.Occup Heal，2013，29（9）：1091-1093.［穆慧玲，张清俊，杨昌林，等.高功率微波辐射对小鼠睾丸氧化应激及ATPase的影响［J］.职业与健康，2013，29（9）：1091-1093］.

［8］Hong Y，Chen F，Wang XM，et al.Study on the heart injury by bisphenol-A and its mechanisms in mice［J］.Prac Prev Med，2013，20（3）：273-276.［洪燕，陈锋，王晓梅，等.双酚A对小鼠心脏损伤及其机制初步探讨［J］.实用预防医学，2013，20（3）：273-276］.doi：10.3969/j.issn.1006-3110.2013.03.006.

［9］Kai YX.Activition of Na＋+K＋-ATPase［J］.Biochem Biophys Res Commun，2005，338：1669-1677.doi：10.1016/j.bbrc.2005.10.067.

［10］Gong Y，Pan X，Huang Y，et al.NP-induced biophysical and biochemical alterations of rattesticular Sertoli cell membranes related to disturbed intracellular Ca2+homeostasis［J］.Toxicol Lett，2008，183（1/2/3）：10-20.doi：10.1016/j.toxlet.2008.08.011.

（2016-06-13收稿2016-09-12修回）

（本文编辑胡小宁）

The effect of cigarette smoke exposure on ATPase enzyme activity in testis of male rats

ZHANG Jing,ZHONG Chunxue,HUANG Yunfei,ZHANG Chen△,HE Lijuan,ZOU Ying
Department of Toxicology,College of Public Health,Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,China△

ObjectiveTo explore the effect of cigarette smoke exposure on testis structure and ATPase enzyme activity in testis of rats.MethodsSeventy adult male SD rats were randomly divided into the control group(10 rats)and the low,medium,high-dose groups(20 rats in each group,which received the exposure of 10,20,30 sticks of cigarettes respectively).The experimental group was exposed to cigarette smoke for 30 min per day.Each dose group was exposed for six weeks and twelve weeks(10 rats each time).The body weights in each group were recorded during the experiment.At the end of the experiment,testes of rats were removed,and the testicular tissue structure was observed by HE staining.Na+-K+-ATPase enzyme and Ca2+-ATPase enzyme activity of testicular tissue of rats were detected by enzyme-linked immunosorbent assay.ResultsWith the increasing of exposure doses,the body weights of rats decreased(P＜0.05).The microstructure changes of testis were observed in the experimental group,and with the increasing of exposure time and exposure dose,the damage was gradually worse.After 6-week exposure,the Na+-K+-ATPase enzyme activity of testicular tissue was significantly lower in high dose group than that of rest of three groups(P＜0.05),and the Ca2+-ATP enzyme activity was significantly lower than that of the control group(P＜0.05).The activities of Na+-K+-ATPase enzyme and Ca2+-ATPase enzyme in testicular tissue were significantly decreased in the low,medium and high-dose groups than those of control group after being exposed for 12 weeks(P＜0.05).ConclusionCigarette smoke exposure can retard the weight gain,cause the testis tissue damaged and decrease the activities of Na+-K+-ATPase enzyme and Ca2+-ATPase enzyme in testis of male rats.

smoking,tobacco;amog;rats,Sprague-Dawley;testis;adenosine triphosphatases;sodium-potassiumexchanging ATPase;calcium-transporting ATPases

R114

A

10.11958/20160545

国家自然科学基金资助项目（81260433）；新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目（2014211C015）

乌鲁木齐,新疆医科大学公共卫生学院毒理学教研室（邮编830011）

张静（1979），女，副教授，博士，主要从事生殖发育毒理方向研究

△通讯作者E-mail:zhangchendr@163.com