2型糖尿病合并抑郁症大鼠模型的建立及评价*

李 娜， 刘 群， 李晓娟， 白晓晖， 刘玥芸， 金钟晔， 景玉霞,2, 严志礻韦, 陈家旭△

(1. 北京中医药大学基础医学院， 北京 100029； 2. 新疆医科大学中医学院， 乌鲁木齐 830054)



2型糖尿病合并抑郁症大鼠模型的建立及评价*

李 娜1， 刘 群1， 李晓娟1， 白晓晖1， 刘玥芸1， 金钟晔1， 景玉霞1,2, 严志礻韦1, 陈家旭1△

(1. 北京中医药大学基础医学院， 北京 100029； 2. 新疆医科大学中医学院， 乌鲁木齐 830054)

目的：建立2型糖尿病合并抑郁症大鼠模型并进行评价，为进一步研究该病提供动物模型。方法：将24只Wistar大鼠随机分为3组(n=8)：正常组(N组)、2型糖尿病组(T组)、2型糖尿病合并抑郁症组(T+D组)。采用高脂饲料喂养加腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ)的方法制备2型糖尿病模型，在其基础上再用21 d慢性束缚的方法建立2型糖尿病合并抑郁症大鼠模型。21 d慢性束缚后做口服葡萄糖耐受试验(OGTT)和胰岛素耐受试验(ITT)；利用行为学设备对大鼠旷场实验进行分析，了解大鼠的抑郁程度；取材后用ELISA法检测大鼠血清5-羟色胺(5-HT)和多巴胺(DA)，验证评价模型是否成功。结果：在ITT和OGTT中，T组和T+D组的血糖在180 min后没有恢复到正常水平；旷场行为学分析表明T+D组大鼠5 min内最大移动距离，中央区滞留时间和中央区滞留次数降低；T+D组血清中5-HT和DA含量降低。结论：本实验利用高脂饲料喂养加腹腔注射小剂量STZ及21 d慢性束缚的方法，成功复制2型糖尿病合并抑郁症大鼠模型，适用于后续研究。

2型糖尿病合并抑郁症；大鼠模型；链脲佐菌素；胰岛素耐受试验；口服葡萄糖耐受试验；5-羟色胺；多巴胺；旷场实验

糖尿病与抑郁症是目前多发的疾病，两者又经常同时发病，两者均存在学习能力、记忆能力等认知功能障碍[1,2]，糖尿病合并抑郁症的症状为糖、蛋白质及脂肪代谢紊乱，持续高血糖并伴有情绪障碍，主要为情绪低落、兴趣减退、悲观、失望、睡眠障碍，且患者的抑郁症状越严重认知功能损害也越严重，导致社会关系恶化，严重者有自杀倾向[3]，给社会和家庭带来极大的负担。国内资料表明，国内糖尿病人群中抑郁症状的发病率为32.4%，高于正常人群的发病率[4]，糖尿病伴发抑郁症的危险因素为性别、年龄、婚烟状况、病程、并发症数目、长期高血糖等，次要危险因素是胆固醇和甘油三酯的水平[5]。糖尿病合并抑郁症的具体机制尚不明朗，用链脲佐菌素( streptozotocin, STZ)诱发糖尿病模型历史较长，有50年的历史[6，7]，本课题组采用的21 d慢性束缚建立抑郁症模型也有良好稳定的实验基础[8]。因此本课题组采用高脂饲料喂养加腹腔注射小剂量STZ的方法制备2型糖尿病模型，并在其基础上再用21d慢性束缚应激抑郁的方法建立2型糖尿病合并抑郁症大鼠模型。前期实验从大鼠的空腹血糖，体重和旷场实验的5 min内总移动距离和移动速度对此模型进行了探讨[9]，本实验继续从胰岛素耐受试验(insulin tolorance test, ITT)、口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test, OGTT)、血清5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)和多巴胺(dopamine, DA)变化、旷场实验大鼠5 min内最大移动距离(max movement distance)和在中央区滞留时间(zone definition)和中央区滞留次数(zone frequency)对此模型进行进一步评价。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级Wistar大鼠38只，雄性，4周龄，体重(170±20) g。购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2012-0001]。实验在北京中医药大学屏障环境动物实验室进行[SYXK(京)2011-0024]。

1.1.2 试剂、仪器、药品制备 STZ: Sigma公司(美国)。一水合柠檬酸：西陇化工股份有限公司(中国)。二水合柠檬酸三钠：国药集团化学试剂有限公司(中国)。强生稳豪型血糖仪及配套试纸(美国)。大鼠束缚架：自制，木质结构，上面两侧分别有两条可以调节的粘贴软带，分别用来束缚大鼠的胸部和腹部(中国)。大鼠旷场行为测试箱：自制，木质(长×宽×高为100 cm×100 cm×40 cm)，底面由黄色线条划分成面积相等的25个方格(中国)。计算机WV-CP470摄像头(Panasonic)(日本)。The Obserber. 5.0分析软件(Noldus，Netherlands)，EthoVision 3.0分析软件(Noldus，Netherlands)进行分析(荷兰)。大鼠5-羟色胺酶联免疫试剂盒(Lot: 20141130. 60087R)。大鼠多巴胺酶联免疫试剂盒(Lot: 20141130. 60088R)，仪器：Thermo Multiskan MK3(芬兰)。

1.1.3 饲料 基础饲料由北京中医药大学动物中心提供[SCXK(京)2009-0012]；高脂饲料购自北京华阜康公司(配方：68.8%基础饲料、10%蔗糖、10%猪油、10%蛋黄粉、1%胆固醇、0.2%胆盐)[SCXK(京)2009-0008]。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 38只大鼠均SPF级饲养，每天12 h光照维持，昼夜循环，自由饮水进食。适应性喂养1周后，按体重随机分为两组，其中8只为正常组，饲以普通饲料，其余30只大鼠饲以高脂饲料。6周后，夜间禁食14 h后，高脂饲料组腹腔注射STZ (35 mg/kg溶于0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液，pH 4.4)于3 d后及7 d后测空腹血糖，测得两次血糖值> 11.1 mmol/L者为2型糖尿病造模成功[10]。选取造模成功的19只大鼠，按血糖高低编号，用Excel表进行随机分组，分为2型糖尿病模型组(T组)，2型糖尿病合并抑郁症模型组 (T+D组)。

1.2.2 2型糖尿病模型成功后慢性束缚应激模型的建立 2型糖尿病合并抑郁症造模参考[11，12]，并进行改良，采用本课题组长期稳定的慢性束缚应激抑郁模型[13]，即将2型糖尿病大鼠捆绑在自制的束缚架上造模，随机选取时间进行束缚，3 h/d，连续21 d。正常组及2型糖尿病组不予束缚，但在相同的时间内禁食禁水。

1.2.3 观测指标与方法 (1)胰岛素耐受试验：在慢性束缚21 d后进行胰岛素耐受试验，非麻醉状态下5 min内皮下注射胰岛素0.6 u/kg，通过尾静脉采血，测定0 min、30 min、60 min、120 min、180 min的血糖值，观察和评价大鼠的胰岛损伤情况。

(2)口服葡萄糖耐量试验：在慢性束缚21 d后进行口服葡萄糖耐量试验，根据WHO推荐的方法在非麻醉状态下5 min内灌喂葡萄糖2.5 g/kg[14]，通过尾静脉采血，测定0 min、30 min、60 min、120 min、180 min的血糖值，观察和评价大鼠糖耐量情况。

(3)血清5-HT和DA：禁食12 h后，麻醉后腹主动脉采血2 ml，分装在一次性自动定量采血管中，3 000 r/min离心30 min，分离血清后收集，于-20℃冻存备用，5-HT和DA采用ELISA法测定。

(4)旷场实验 (open field test)：在安静、遮光的环境下进行。将大鼠放入箱内底面中心，利用同步录像、计时，观察5 min内大鼠在旷场行为测试箱内的活动情况。每只大鼠检测完毕后用70%酒精清洗方箱内壁及底面，以免上次大鼠余留的信息(如大鼠的大、小便、气味)影响下次测试结果。更换大鼠，继续实验。观察指标如下：最大移动距离：5 min内大鼠最大的运动长度；中央区滞留时间：5 min内大鼠于中央区滞留的时间；中央区滞留次数：5 min内大鼠于中央区滞留的次数。

2 结果

2.1 胰岛素耐受试验

给予高脂饲料及腹腔注射STZ制备2型糖尿病模型并21 d慢性束缚刺激后，T组和T+D组胰岛素受损，在0、30、60、120、180 min各组大鼠血糖均升高，与N组比较差异有显著性(P<0.01，图1，见彩图页Ⅲ)，T+D组与T组大鼠在180 min没有恢复到正常水平T+D组高于T组，两组相比，差异有显著性(P<0.05)。

2.2 口服葡萄糖耐量试验

给予高脂饲料及腹腔注射STZ制备2型糖尿病模型并21 d慢性束缚刺激后，T组和T+D组糖耐量明显受损，在0、30、60、120、180 min各组大鼠血糖均升高，与N组比较差异有显著性(P<0.01)，T+D组与T组大鼠在180 min没有恢复到正常水平，两组相比，差异有显著性(P<0.01，图2，见彩图页Ⅲ)，且T组和T+D组的空腹血糖高于7 mmol/L、2 h的血糖水平高于11.1 mmol/L，3 h还未恢复正常。

2.3 血清5-HT和DA

血清中5-羟色胺，与N组比较，T组和T+D组差异无显著性，T组和T+D组两组相比，差异有显著性(P<0.01)；血清中多巴胺，T组和T+D组差异无显著性，T组和T+D组两组相比，差异无显著性。

Tab. 1 5-hydroxytryptamine and Dopamine(±s, n=8)

5-HT： 5-hydroxytryptamine； DA: Dopamine； N： Normal group； T： T2DM group； T+D: T2DM with depression group; T2DM: Type 2 diatebetes mellitus

**P<0.01vsT

2.4 旷场实验行为学

给予高脂饲料及腹腔注射STZ制备2型糖尿病模型并21 d慢性束缚刺激后，T组和T+D组的最大移动距离均减少，T组与N组比较差异无显著性，T+D组与N组比较差异有显著性(P<0.01)，T组与T+D组比较差异无显著性；T+D组于中央区的滞留时间减少，与N组相比差异有显著性(P<0.05)，T组与T+D组相比差异有显著性(P<0.05)；T组与T+D组于中央区的滞留次数没有减少，与N组相比差异无显著性，T组与T+D组相比差异无显著性。

GroupMaxmovementdistance(cm)Zonedefinition(s)ZonefrequencyN11.688±0.87918.033±11.3821.375±0.518T9.305±3.15619.765±8.1481.375±1.061T+D6.061±2.273**7.409±6.499*#1.125±0.354

N： Normal group； T： T2DM group； T+D: T2DM with depression group; T2DM: Type 2 diabetes mellitus

*P<0.05，**P<0.01vsN；#P<0.05vsT

3 讨论

糖尿病作为一种终身疾病，需要患者长期服用降糖药物或者长期注射胰岛素等措施缓解病情。目前为止尚且没有治愈的方法，糖尿病患者需要定期检测血糖并有并发症的发生，且长期服药会产生心理压力，这些都使患者产生焦虑抑郁情绪，产生严重的心理负担，2004年中国糖尿病防治指南表明糖尿病心理障碍是糖尿病的14种常见并发症之一[15]。有研究显示糖尿病合并抑郁症时，患者的抑郁症状和认知功能损害均比单独患抑郁症者更为严重[16]，抑郁症全面影响患者的日常生活，影响患者的饮食、运动、睡眠、血糖监测，降低患者治疗的依从性。因此用动物模型进行2型糖尿病合并抑郁症的研究，能很好的研究2型糖尿病合并抑郁症的发病机理。

本研究综合运用高脂饲料喂养加腹腔注射STZ，并在其基础上采用21 d慢性束缚的方法造成大鼠的抑郁状态，从而建立2型糖尿病合并抑郁症大鼠模型。在胰岛素耐受试验中，2型糖尿病合并抑郁症大鼠在注射胰岛素后血糖水平降低，在注射180 min后仍然没有恢复正常水平，而正常组大鼠恢复到正常水平，表明糖尿病大鼠的胰岛功能降低。在口服葡萄糖耐受试验中，2型糖尿病组和2型糖尿病合并抑郁症组的糖耐量严重受损，且空腹血糖高于7 mmol/L，120 min的血糖水平高于11.1 mmol/L，180 min还未恢复，符合T2DM的临床诊断标准[17]。2型糖尿病合并抑郁症大鼠血清中5-HT水平降低，与正常组相比有明显差异，而5-HT是一种能产生愉悦情绪的信使，能调节情绪、精力、记忆力，5-羟色胺水平较低的人群更易发生抑郁、冲动行为、自杀及暴力行为[18]。而多巴胺主要负责大脑的情欲、感觉，将兴奋及开心的信息传递，也与上瘾有关，本实验中2型糖尿病合并抑郁症大鼠的多巴胺水平降低，本实验通过21 d慢性束缚的方法，导致糖尿病大鼠的神经递质水平发生改变。旷场实验可以评定大鼠在新异环境中的启动、探究行为和对新环境的警觉性，最大移动距离初步评价大鼠的自发活动度。本实验中2型糖尿病合并抑郁症模型大鼠的最大移动距离明显小于正常大鼠和2型糖尿病大鼠，表明2型糖尿病合并抑郁症模型大鼠的自发活动度减小[19，20]，2型糖尿病合并抑郁症大鼠中央区的滞留时间和次数减少，反应大鼠的焦虑和抑郁情况，说明21 d慢性束缚应激抑郁模型建立成功。这同临床上2型糖尿病合并抑郁症患者不思饮食、体重下降、血糖监控较差，胰岛功能降低、认知功能障碍、情绪低落，活动减少、治疗依从性低，在一定程度上有一致性。因此提示成功复制2型糖尿病合并抑郁症大鼠模型，有利于后续的实验研究。提示抑郁症患者在降糖治疗和改善认知治疗的同时合并抗抑郁治疗[21],可以改善患者的精神状况。

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*【基金项目】卫生部科学研究基金—浙江省医药卫生重大科技项目(WKJ 2009-2030)；全军医药卫生科研项目(08MA059) 【收稿日期】2014-08-29 【修回日期】2014-10-27

△【通讯作者】Tel： 0577-86689817； E-mail： wwt@wzmc.edu.cn

Establishment and evaluation of a rat model of type 2 diabetes associated with depression

LI Na1, LIU Qun1, LI Xiao-juan1, BAI Xiao-hui1, LIU Yue-yun1, JIN Zhong-ye1,JING Yu-xia1,2, YAN Zhi-yi1, CHEN Jia-xu1△

(1. School of Basic Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029; 2. College of Chinese Medicine, Xinjiang Medical University, Urumchi 830054, China)

Objective: To establish and evaluate a rat model of type 2 diabetes mellitus (T2DM) associated with depression for further elaborating the disease. Methods: Twenty-four Wistar rats were randomly divided into three groups: normal group (group N), T2DM group (group T) and T2DM with depression group (group T+D), with 8 rats in each group. The T2DM rat model was induced by high fat diet and low dose of Streptozotocin (STZ) injection, and in addition, the T2DM rats were made restraint stress for 21 days. After the model was established, the insulin tolerance test (ITT) and oral glucose tolerance test (OGTT) were performed. Then the rat depression level was analyzed by open field test, and the concentration of 5-hydroxytryptamine (5-HT) and dopamine (DA)was determined by ELISA to confirm the model identity. Results: The blood glucose level in group T and group T+D didn’t return to the normal level at 180 minutes in the ITT and OGTT test；Compared with the group N, the max movement distance, retaining time in the central zone and the retaining frequency within 5 minutes in the group T+D decreased; 5-HT and DA level in the serum of rats in group T+D was reduced. Conclusion: A rat model of type 2 diabetes mellitus associated with depression has been successfully established by high fat diet and injection of low dose streptozotocin in combination with restraint stress for 21 days. This rat model is useful for further relevant studies.

type 2 diabetes mellitus associated with depression; rats model; streptozocin; insulin tolerance test; oral glucose tolerance test; 5-hydroxytryptamine; dopamine; open field test

国家自然科学基金项目(81072756)；北京中医药大学创新团队项目资助(2011CXTD-07)；国家自然科学基金资助项目(81473597)

2014-08-13 【修回日期】2014-10-31

R332

A

1000-6834(2015)01-023-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.008

△【通讯作者】Tel： 010-64286656； E-mail： chenjx@bucm.edu.cn