慢性炎性痛大鼠脊髓背角单羧酸转运蛋白-2表达的变化*

何建华， 徐 黎， 沈 羽， 孔明建， 石林玉， 马正良

(南京医科大学附属鼓楼临床学院麻醉科， 江苏 南京 210008)



慢性炎性痛大鼠脊髓背角单羧酸转运蛋白-2表达的变化*

何建华， 徐 黎， 沈 羽， 孔明建， 石林玉， 马正良△

(南京医科大学附属鼓楼临床学院麻醉科， 江苏 南京 210008)

目的：在大鼠慢性炎性痛模型上，观察大鼠脊髓背角单羧酸转运蛋白-2(MCT-2)表达的变化。方法：健康雄性SD大鼠96只，体重180～220 g，采用随机数字表法将其随机分为2组(n=48)：生理盐水组(NS组)和完全性弗氏佐剂组(CFA组)。CFA组左侧后足足底中部皮下注射完全性弗氏佐剂(CFA)100 μl；NS组注射等量的生理盐水。在注射前(T0)及注射后3 h(T1)、第1天(T2)、3天(T3)、5天(T4)、7天(T5)、14天(T6)和第21 天(T7)测定大鼠机械缩足反应阈值(MWT)和热缩足反应潜伏期(TWL)，并于上述各时间点分别随机取4只大鼠，处死后取脊髓背角，采用Western blot 法测定MCT-2表达的变化。结果：CFA组大鼠在注射CFA后3 h即出现痛觉过敏，并持续至第14 天，其疼痛程度显著大于NS组(P<0.05)；且T1-6时脊髓背角MCT-2与NS组相比显著增加(P<0.05)。大鼠脊髓背角MCT-2的表达与MWT和TWL相关(P<0.05，P<0.01)。结论：慢性炎性痛大鼠脊髓MCT-2表达上调，该变化可能参与慢性炎性痛中枢敏化的形成和维持。

单羧酸转运蛋白-2；慢性炎性痛；脊髓；突触可塑性；大鼠

慢性疼痛给患者身心造成极大的痛苦，但由于其发生机制尚未阐明，导致治疗困难。中枢敏化是慢性疼痛的主要机制之一，近年来研究发现，神经元及胶质细胞参与的突触可塑性在中枢敏化过程中发挥重要作用[1，2]。

单羧酸转运蛋白(monocarboxylate transporter, MCT)是一类跨膜蛋白,它的主要功能是转运单羧酸类物质如乳酸、丙酮酸和酮体等进出细胞。中枢神经系统主要表达MCT-1、MCT-2和MCT-4，其中神经元主要表达MCT-2。新近研究发现，MCT在介导星形胶质细胞与神经元的乳酸转运过程中起关键作用，该转运过程参与了突触长时程增强(LTP)的形成和维持[3，4]。由此可见，MCT在中枢神经系统的突触可塑性中起重要作用。但是，MCT尤其是分布于神经元上的MCT-2在慢性疼痛导致的中枢敏化的形成和维持过程中是否存在作用，尚不清楚。本实验拟探讨慢性炎性痛大鼠脊髓背角神经元MCT-2的变化，研究MCT-2在慢性炎性痛中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料和模型制备

实验动物 健康成年雄性SD 大鼠96 只( 体重(180～220) g; 由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，采用随机数字表法将其随机分为2组: NS组和CFA 两大组(n=48)，每大组又分为注射前、注射后3 h、第1天、3天、5天、7天、14天和第21 天(T0、T1、T2、T3、T4、T5、T6和T7)8个亚组(n=6)。

动物模型的制作：完全性弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant， CFA) 组：七氟醚麻醉大鼠并消毒左后肢，于其左侧后足足底中部皮下注射CFA(Sigma公司 美国)100 μl；NS组左后足底中部皮下注射等量的生理盐水。

1.2 疼痛行为学观察

在皮下注射生理盐水或CFA前(baseline)及注射后3 h、第1天、3天、5天、7天、14天 和第21天进行行为学测定。所有测定均在固定时间(15∶00～18∶00)的安静的环境下进行。

1.2.1 机械缩足反射阈值(mechanical withdrawl threshold，MWT)的测定 按Chaplan 等[5]报道方法测定MWT。将大鼠置于透明的有机玻璃箱中，底为(0.5×0.5) cm2的铁丝网。实验前使之适应环境30 min。以不同折力(buckling force) 的Von Frey 纤毛( Stoelting 公司，美国) 刺激大鼠左后足底中部。从2.0 g开始，以up-down 法推测阈值，并在阈值上下各刺激5 次，使用内推法计算出50% 反应阈值(即引起5 次试验中2.5 次反应的值) 。最大折力为15 g，大于此值时记为15 g。每次实验至少间隔15 s，并待刺激引起的行为反应( 如舔足等) 完全消失后再给予下一次刺激。

1.2.2 热缩足反射潜伏期(thermal withdrawl latency，TWL) 的测定 将自制的有机玻璃箱置于3 mm 厚的玻璃板上，将大鼠放入有机玻璃箱内，使其自由活动30 min 以适应测试环境和温度。室温稳定在25℃±1.0℃。按Hargreaves 等[6]法用BME-410A 型热痛刺激仪( 中国医学科学院生物医学研究所)照射大鼠左后足底中部稍后。照射开始至大鼠出现抬腿回避时间为TWL，当大鼠后爪移动时，停止照射。照射自动切断时间为20 s，以防止时间过长造成组织损伤。整个实验过程中，热刺激强度保持相同。重复刺激5 次，每次刺激间隔2 min以上，计算时取后3 次TWL 的平均值。

1.3 Western blot 法检测MCT-2表达

于T0-T7各时间点取材，每组各取4只大鼠经戊巴比妥麻醉后，快速在冰面上取L4～L6 节段脊髓背角置于液氮中保存。用全蛋白提取试剂盒按操作流程提取蛋白后，应用 BCA 法测定蛋白浓度，取20 μg 蛋白进行 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，应用湿转膜法，转移稳定电流 250 mA，1.5 h可将蛋白转移到 PVDF 膜上。TBST洗膜后，用 5% 脱脂牛奶封闭1 h，在 4℃ 条件下用1∶500 稀释的兔抗 MCT-2抗体(英国ABcam公司)孵育过夜。洗膜后，用1∶5 000 的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG 抗体(英国ABcam公司)室温孵育 2 h 。再次洗膜后，用 ECL 发光试剂盒在暗室内显像。用灰度扫描仪检测出相应MCT-2条带的平均灰度值，以代表MCT-2的相对表达量。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 疼痛行为学测定

与NS组大鼠相比，CFA组大鼠在制模后3 h即出现痛觉过敏及触诱发痛，并持续至第14 d，CFA组T1-T6时MWT及TWL降低，与NS组相比差异明显；该结果表明，本实验的大鼠CFA慢性炎性痛模型稳定、可靠(P<0.05，表1、2)。

Tab. 1 Comparison of mechanical withdrawl threshold between the two groups(g， ±s, n=6)

CFA: Complete Freund’s adjuvant; T0-T7： Represent baseline, 3 h, 1 d, 3 d, 5 d, 7 d, 14 d, 21 d respectively

*P<0.05vsthe NS group;#P<0.05vsT0group

Tab. 2 Comparison of thermal withdrawl latency between the two groups(g， ±s, n=6)

CFA: Complete Freund’s adjuvant; T0-T7： Represent baseline, 3 h, 1 d, 3 d, 5 d, 7 d, 14 d, 21 d respectively

*P<0.05vsthe NS group;#P<0.05vsT0

2.2 MCT-2的表达

MCT-2在大鼠脊髓背角的表达存在相应的改变。使用 Western blot 法测定，CFA组大鼠T1-T6各时点脊髓背角中MCT-2的表达显著高于NS组(P<0.05)，各组内参无变化。NS组各时点之间无变化；本实验结果表明，在大鼠慢性炎性痛形成和维持过程中脊髓背角神经元MCT-2的表达存在显著的变化(图1，表3)。

Fig.. 1 Western blot for the change of MCT-2 in CFA group

Tab. 3 Comparison of monocarboxylate transporter-2 between the two groups(±s, n=4)

CFA: Complete Freund’s adjuvant; T0-T7： Represent baseline, 3 h, 1 d, 3 d, 5 d, 7 d, 14 d, 21 d respectively

*P<0.05vsthe NS group;#P<0.05vsT0

2.3 MCT-2表达与行为学改变的关系

将NS组和CFA组所有大鼠在第 21天 处死前的疼痛行为学MWT及TWL测定值和 MCT-2的表达(Western blot 法)进行Pearson相关性分析显示：脊髓MCT-2的表达与大鼠MWT和TWL均呈正相关(P<0.05，P<0.01)；该结果表明，慢性炎性痛大鼠脊髓背角MCT-2的表达与痛行为学的改变显著相关。

3 讨论

急、慢性炎性痛形成和维持过程中均存在痛觉敏化现象，因此，急慢性炎性痛脊髓背角神经元敏化机制的研究具有重要意义[7，8]。完全性弗氏佐剂所致的大鼠慢性炎性痛模型成熟、稳定，在以往的研究中广泛使用。本实验行为学结果与先前的文献报道类似，因此，本实验所用的动物模型是可靠的。

单羧酸转运蛋白(MCT)是哺乳动物细胞的重要跨膜蛋白，涉及细胞的多种功能，包括胞内pH值调节以及丙酮酸、乳酸等单羧酸和乙酰乙酸、β羟丁酸等酮体和甲状腺激素等的跨膜转运，目前为止已克隆出至少14个家族成员。MCT在动物体内分布存在明显的组织特异性，中枢神经系统主要表达MCT-1、MCT-2和MCT-4，其中神经元主要表达MCT-2，星形胶质细胞表达MCT-1和MCT-4。星形胶质细胞是中枢神经系统中主要的糖原储存细胞，星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭机制表明，神经元活动期间不仅通过葡萄糖直接获得能量供给，同时神经元还通过星形胶质细胞及血管内皮细胞上的MCT-1和MCT-4释放乳酸，神经元表面的MCT-2摄取胶质细胞中释放的乳酸也作为其主要能量代谢底物[9]。由此可见，MCT在神经系统的能量供应中发挥十分重要的作用。

近来Pierre J. Magistretti等[3]研究发现，海马星形胶质细胞向神经元转运乳酸在长时程记忆形成中发挥重要作用。他们通过训练大鼠学习记忆逃避反应的同时运用在体微透析技术监测海马乳酸浓度，发现训练后大鼠海马局部乳酸浓度升高，而预先定位注射糖原磷酸化酶抑制剂DAB和α糖苷酶抑制剂未升高，定位注射反义寡核苷酸敲除MCT-1、MCT-2和MCT-4能抑制大鼠海马MCT表达，阻断逃避反应记忆的形成。同时电生理学实验证实，抑制MCT的乳酸转运能消除海马L-LTP的形成和维持，而对短时记忆无效[3]。由此可见，MCT在介导星形胶质细胞及神经元的乳酸转运，参与神经元突触可塑性，尤其是长期改变方面发挥重要作用。

神经元突触可塑性是中枢敏化的主要机制之一，LTP是中枢敏化机制重要的表现形式。本研究结果表明，在慢性炎性痛的形成和维持过程中，作为疼痛调控重要中枢的脊髓背角MCT-2表达明显上调，其升高幅度与大鼠的痛行为明显相关，由此提示，MCT-2可能参与慢性炎性痛脊髓背角的敏化过程。由于MCT在LTP形成和维持中的重要作用，因此我们推测，脊髓背角神经元上MCT-2可能通过影响脊髓背角神经元LTP参与了慢性炎性疼痛所致的脊髓中枢敏化过程。同时，脊髓背角神经元上MCT-2参与疼痛也可能与星形胶质细胞和血管膜上的MCT-1和MCT-4有关。由此，脊髓MCT-2的改变有可能成为我们寻求治疗慢性炎性疼痛导致的中枢敏化的靶点之一。

关于脊髓背角神经元MCT-2参与慢性炎性疼痛的可能机制，推测在慢性炎性疼痛的持续刺激下，脊髓背角神经元兴奋性增强，能量需求增加，其通过调节胞内相关基因进而调控MCT-2蛋白表达增加，增加向胞内运送乳酸，满足神经细胞的能量需求。同时，长时间的神经元兴奋所致的MCT-2的表达增强，有可能通过激活胞内的CREB、Arc及Cofilin等有关的信号转导通路，介导中枢敏化病理过程的发生和发展[10-12]。当然，本研究结果只是初步表明了脊髓背角神经元MCT-2可能参与了慢性炎性疼痛的形成和维持，关于其参与复杂的慢性疼痛进程的可能机制以及在其他急慢性疼痛过程中有何作用还有待于进一步研究。

综上所述，慢性炎性痛大鼠脊髓背角MCT-2表达水平明显升高，其升高幅度与大鼠痛敏行为学变化明显相关，其可能参与慢性炎性痛大鼠脊髓水平中枢敏化的调控。

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The changes of monocarboxylate transporter-2 in spinal cord horn in a rat model of chronic inflammatory pain

HE Jian-hua, XU li, SHEN Yu, KONG Ming-jian, SHI Lin-yu, MA Zheng-liang△

(Department of Anesthesiology, the Affiliate Drum Tower Clinical College of Nanjing Medical University, Nanjing 210008， China)

Objective: To investigate the changes in the levels of monocarboxylate transporter-2 in spinal cord horn in a rat model of chronic inflammatory pain. Methods: Male SD rats weighting 180～220 g were randomly divided into two groups(n=48): normal saline group (NS group), complete Freund’s adjuvant group (CFA group). Rats were given injections of CFA 100 μl in left hind paw in group CFA, and an equal volume of saline was given injection in group NS. Mechanical withdraw threshold(MWT) and thermal withdraw latency(TWL) were measured at before injection(T0) and 3 h, 1 d, 3 d, 7 d, 14 d, and 21 d after injection(T1-7). Four rats were chosen from each group at T0-7and sacrificed, and L4-5 segments of the spinal cord horn were removed for measurement of the expression of monocarboxylate transporter-2 by Western blot analysis. Results: In CFA group, mechanical hyperalgesia and allodynia appeared on the 3 h after CFA injection, then until the day 14. The expression of monocarboxylate transporter-2 in the spinal dorsal horn of rats in CFA group was significantly higher than that in normal control group at T1-6(P<0.05). The protein level of monocarboxylate transporter-2 was apparently correlated with MWT and TWL(P<0.01 andP<0.05) in CFA group. Conclusion: The level of monocarboxylate transporter-2 in spinal dorsal horn is significantly increased in a rat model of chronic inflammatory pain and the change may involve in the formation and maintenance of central sensitization in spinal cord of chronic inflammatory pain.

monocarboxylate transporter-2； chronic inflammatory pain; spinal cord； synaptic plasticity； rats

国家自然基金资助项目(81070892,81171048)；江苏省麻醉学重点学科资助项目(XK201140)

2014-07-08 【修回日期】2014-10-24

R73-3

A

1000-6834(2015)01-019-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.007

△【通讯作者】Tel： 025-83105502； E-mail: mazhengliang1964@nju.edu.cn