缺氧/复氧大鼠心肌中IL-1β浓度的动态变化及意义*

何金波, 包财盈, 叶玉柱, 罗梓垠, 应 磊， 王万铁

(温州医科大学缺血/再灌注损伤研究所， 浙江 温州 325035)



缺氧/复氧大鼠心肌中IL-1β浓度的动态变化及意义*

何金波, 包财盈, 叶玉柱, 罗梓垠, 应 磊， 王万铁△

(温州医科大学缺血/再灌注损伤研究所， 浙江 温州 325035)

目的：探讨大鼠心肌中白细胞介素-1β(IL-1β)在心肌缺氧/复氧过程中的动态变化及其意义。方法：采用Langendorff方法制备离体大鼠心肌缺氧/复氧模型。40只雄性SD大鼠随机分为对照组(A组)和缺氧/复氧组( H/R组)。H/R组按照复氧时间分为H/R 0.5 h、H/R 1 h、H/R 2 h组(B、C、D组)(n=10)。连续纪录各组左室发展压(LVDP)、左心室发展压最大上升/下降速率(± dp/dtmax)的变化，ELISA检测各组心肌IL-1β和肌酸激酶同工酶(CK-MB)的浓度，RT-PCR检测心肌IL-1β mRNA 的表达水平，光镜观察心肌结构。结果：与对照组相比，H/R组大鼠 LVDP、 ± dp/dtmax值均降低(P<0.05)，心肌中IL-1β的含量及IL-1β mRNA 的表达明显升高(P<0.05)，CK-MB浓度上升(P<0.05)，随复氧时间的延长以上指标的变化更明显,B、C、D组间两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，H/R 2 h组心肌中的IL-1β、CK-MB的浓度以及IL-1β mRNA 的表达量与A、B、C组相比，达到最高(P<0.05)。结论：大鼠心肌缺氧/复氧后IL-1β在心肌组织中的表达上升并引起心肌再灌注损伤。

IL-1β；心肌缺血/再灌注损伤；血流动力学

心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury，MI/RI)是指缺血心肌在恢复血流灌注后所产生的心肌损伤加重的现象。随着近些年来心肌梗死后冠状动脉再灌注治疗技术的发展，MI/RI成为当今医学领域关注的热点。研究表明，再灌注期间，自由基的大量生成、细胞钙超载、炎症反应、凋亡是导致MIRI的重要原因[1]。作为白细胞介素-1(interleukin-1，IL-1)家族中的一员，IL-1β是反映IL-1系统活性的重要指标[2]，它可以激活免疫细胞产生多种细胞因子促进自由基等的产生和释放，参与介导炎症反应的重要过程[3]。IL-1β与许多心脏疾病，如冠心病、心肌梗死的发生与发展有密切关系[4],并且在缺血性心脏病心肌细胞凋亡的进程中具有重要作用[5]。本研究旨在通过观察IL-1β在大鼠心肌缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)过程中的动态变化，探讨IL-1β在心肌缺血/再灌注损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

RT-PCR引物购自上海生工生物工程技术公司，RT-PCR试剂盒购自美国Thermo公司，大鼠IL-1β ELISA试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司，其它试剂为市售分析纯产品。改良克氏液(Krebs-Henseleit，K-H)：氯化钠 118.5 mmol/L，氯化钾4.8 mmol/L，硫酸镁1.2 mmol/L，磷酸二氢钾1.2 mmol/L，碳酸氢钠25.0 mmol/L，氯化钙2.5 mmol/L，葡萄糖11.1 mmol/L，pH 7.40±0.05。改良ThomasⅡ停搏液：氯化钠110 mmol/L，氯化钾16 mmol/L，氯化钙1.2 mmol/L，碳酸氢钠1.0 mmol/L，氯化镁16 mmol/L，pH 7.80±0.05。

1.2 动物模型的制备与分组

SPF级健康雄性SD大鼠40只，体重(280±30)g，由温州医科大学实验动物中心提供[SYXK(浙)2010-0150]。将大鼠随机分为空白对照组(A组)、缺氧/复氧30 min组(B组)、缺氧/复氧1 h组(C组)、缺氧/复氧2 h组(D组)(n=10)。大鼠称重后，用5%水合氯醛(7～8)ml/kg腹腔注射麻醉，开腹，经下腔静脉注射肝素(1 000 U/kg)抗凝，迅速开胸取出心脏，将心脏悬挂在Langendorff离体心脏灌流装置上，经主动脉进行逆行灌注，恒温恒压灌流，灌注液温度(37±0.5)℃，灌注压100 mmHg。A组在建立Langendorff离体心脏灌注模型的基础上，平衡灌注20 min后将心脏保存；B、C、D组在平衡灌注20 min后，持续灌注改良ThomasⅡ停搏液3 min，使心脏完全停搏，继而停灌30 min，然后再复灌恒温恒压并通有混合气体的K-H缓冲液使其复跳并持续灌注，复灌的时间分别为30 min、1 h、2 h。

1.3 监测心功能相关指标

从左心耳向左心室插入球囊，球囊内注射适量生理盐水，直至左心室舒张末期压力(left ventricular end dilated pressure ，LVEDP)维持在(4～10)mmHg，通过Powerlab八通道生理记录仪连续记录各组左室发展压(1eft ventricular development pressure，LVDP)、左心室发展压最大上升/下降速率( maximal rates of increase/decrease of the left ventricular pressure，±dp/dtmax)的变化。

1.4 ELISA方法检测心肌组织中IL-1β和CK-MB的蛋白表达水平

取心肌组织100 mg，在超声匀浆机中充分匀浆，将匀浆液转入1.5 ml EP管中，4℃,3 000 r/min，离心15 min，取上清，用BCA试剂盒对上清液进行蛋白定量，用大鼠IL-1β ELISA试剂盒和大鼠CK-MB ELISA试剂盒进行IL-1β和CK-MB蛋白表达水平的检测。

1.5 RT-PCR方法检测心肌组织中IL-1β mRNA的表达水平

Trizol法提取大鼠心肌组织总RNA，蛋白核酸仪进行RNA浓度检测。按RNA逆转录试剂盒说明书合成cDNA产物。按RT-PCR逆转录试剂盒说明书准备25 μl的反应体系： 模板cDNA 1 μl ，PCR Mix 12.5 μl，上下游引物各1 μl，加三蒸水至25 μl。IL-1β的上游引物为5’-CTTCAAATCTCACAGCAGCATC-3’，下游引物为5’-GCTGTCTAATGGGAACATCACA-3’，扩增片段长度：220 bp。PCR反应条件：94℃ 预变性3 min，进入循环：94℃ 30 s，59.6℃ 30 s，72℃ 1 min，28个循环，再72℃ 5 min。β-actin上游：5’-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3’，下游：5’-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3’，扩增片段长度：432 bp。PCR反应条件：94℃ 预变性3 min，进入循环：94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，29个循环，再72℃ 5 min。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，用MUVB-20凝胶图像分析仪进行灰度值扫描，拍照。用Quantity One凝胶软件分析系统分析灰度值。

1.6 HE染色标本制备

各组停灌后迅速从心尖部同一部位取材，用10%的甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察心肌组织结构的改变。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 各组动物心功能参数的的比较

与A组相比，B、C、D组的LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax值明显降低(P<0.05)；B、C、D组随着复氧时间延长，LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax的值逐渐下降，B、C、D组间LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax的值两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；D组与其他组相比，LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax值达到最低(P<0.05,表1)。

Group+dp/dtmax(mmHg/s)-dp/dtmax(mmHg/s)LVDP(mmHg)A7096.36±319.52-3318.56±310.28225.31±27.45B6479.32±286.73*-2731.65±359.25*153.89±10.14*C5125.74±241.93*#-2054.57±413.20*#123.32±3.99*#D3070.58±410.64*#Δ-757.93±283.54*#Δ42.16±16.43*#Δ

A: Sham group; B: H/R 0.5 h group; C: H/R 1 h group; D: H/R 2 h group; +dp/dtmax: Maximal rates of increase of the left ventricular pressure; -dp/dtmax: Maximal rates of decrease of the left ventricular pressure;LVDP:Left ventricular development pressure； H/R: Hypoxia /reoxygenation

*P<0.05vsA group;#P<0.05vsB group;ΔP<0.05vsC group

2.2 各组大鼠心肌组织IL-1β和CK-MB蛋白的表达水平

与A组比较，B、C、D组心肌组织中IL-1β的表达明显增高(P<0.05)，CK-MB的浓度上升(P<0.05)；在B、C、D组，IL-1β和CK-MB的水平随着复氧时间的延长而升高，B、C、D组间两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；与A、B、C组相比，D组心肌组织中IL-1β和CK-MB的表达达到到高峰(P<0.05，表2)。

GroupIL-1β(pg/ml)CK-MB(ng/ml)A90.52±17.3522.83±3.79B148.87±19.27*62.82±2.71*C206.21±16.11*#114.71±28.08*#D280.03±55.07*#158.18±7.74*#Δ

A: Sham group; B: H/R 0.5 h group; C: H/R 1 h group; D: H/R 2 h group; IL-1β: Interleukin-1β; CK-MB: Creatine kinase-MB; H/R: Hypoxia /reoxygenation

*P<0.05vsA group;#P<0.05vsB group;ΔP<0.05vsC group

2.3 各组大鼠心肌组织IL-1β mRNA的表达水平

RT-PCR发现，各组心肌组织均见220 bp的IL-1β mRNA条带，对各组的IL-1β mRNA表达进行半定量分析，B、C、D组IL-1β mRNA的表达量与对照组相比显著升高(P<0.01)；随着复氧时间的延长，在B、C、D组，IL-1β mRNA的表达量逐渐升高，B、C、D组间两两比较，差异均有统计学意义(P<0.01)；D组与其他组相比，IL-1β mRNA的表达量达到最高(P<0.01，图1)。

2.4 相关性分析结果

大鼠心肌缺氧/复氧期间LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax的值与心肌组织IL-1β的浓度呈显著负相关(P<0.05)；大鼠心肌组织CK-MB的表达量与心肌组织IL-1β的浓度呈显著正相关(P<0.01)；心肌IL-1β mRNA相对表达量与心肌组织IL-1β的浓度呈显著正相关(P<0.01)；心肌缺氧/复氧期间LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax的值与心肌组织IL-1β mRNA相对表达量呈显著负相关(P<0.05)；大鼠心肌组织CK-MB的表达量与心肌组织IL-1β mRNA相对表达量呈显著正相关(P<0.01)。

2.5 光镜下大鼠心肌组织形态学观察

A组心肌细胞排列整齐，形态正常，细胞核居中，未见炎性细胞浸润;B组心肌细胞大体正常，排列尚有序，部分出现炎性细胞浸润;C组心肌纤维肿胀、变性，部分出现坏死;D组心肌纤维出现大范围断裂、溶解(图2，见彩图页Ⅱ)。光镜下大鼠心肌组织结构观察表明随着复氧时间延长，大鼠心肌组织损伤逐渐加重。

3 讨论

随着冠心病，心肌梗死发病率的节节攀高，溶栓治疗、PCI和搭桥手术在临床上也日趋广泛，这意味着术后心肌缺血/再灌注损伤会成为困绕临床医师的重要问题，自1960年Jennings第一次提出心肌缺血/再灌注损伤的概念以来，其具体机制也一直不断地被探讨，作为一种中介因素，炎症反应贯穿于心肌缺血/再灌注损伤的全过程，不仅能够激活中性粒细胞合成并释放炎症介质，通过级联反应引起血管内皮细胞游走收缩，使血管通透性增加，诱导细胞以及血管细胞粘附分子的表达增加，最终导致再灌注心肌的炎症损伤[6]，而且能够与其他损伤因素相互作用，共同导致心肌的缺血/再灌注损伤[7]。

作为炎症反应的启动因子，IL-1β广泛参与了组织破坏、水肿形成等多种病理损伤过程，在炎症反应介导的机体缺血/再灌注损伤中也发挥着重要作用。有研究表明，脑、肝脏、肾脏等其他器官在经历缺血/再灌注后，炎症通路被激活，炎症因子的表达量升高，而在使用药物或者缺血预处理干预后，相应组织与血浆中IL-1β的含量降低，器官的缺血/再灌注损伤也得到有效缓解[8, 9]。IL-1β可直接上调细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)和内皮白细胞黏附分子-1(endothelial leukocyte adhesion molecule-1, ELAM-1)表达，进而诱导中性粒细胞迁移至心肌缺血区域，通过影响微血管通透性、释放氧自由基等机制导致最终引起心肌再灌注损伤。在李拥军的研究中表明，急性心肌梗死患者在接受PCI治疗后，再灌注过程中血浆IL-1β表达上升，于术后12 h血浆IL-1β水平达到高峰，而在兔的心肌缺血/再灌注模型中，再灌注即刻给予重组人IL-1受体拮抗剂(recombinant human interleukin-1 receptor antagonist, rhIL-1ra)之后，心肌再灌注损伤明显减轻，梗死面积缩小[10]。

本实验采用Langendorff离体灌流系统制备大鼠心脏缺氧/复氧模型，研究结果显示，作为提示心功能早期损伤的敏感指标，复氧期间CK-MB在心肌中的表达量逐渐升高，LVDP、+dp/dt、-dp/dt的值呈下降趋势，随着复氧时间延长，心肌损伤加重。缺氧/复氧组的心肌IL-1β的含量普遍高于对照组(P<0.05)，而在缺氧/复氧组组内，B、C、D组随着再灌注时间的延长，IL-1β的表达量逐渐上升，组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)，反映出心肌的再灌注损伤与再灌注期间IL-1β的高表达所介导的炎症反应有着密切关联。相关性分析结果显示，大鼠心肌缺氧/复氧期间LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax的值与心肌组织IL-1β的浓度呈显著负相关(P<0.05)，心肌组织CK-MB的表达量与心肌组织IL-1β的浓度呈显著正相关(P<0.01)，反映了缺氧/复氧期间心肌损伤的发生与发展和心肌组织中IL-1β的水平有密切关系。病理形态学观察可见，心肌缺氧/复氧后呈明显缺血、坏死性改变，在复氧的不同时间点其表现程度不同，最典型的特征是大量炎细胞浸润，也证实了炎症反应在再灌注损伤中的重要地位。

综上所述，在心肌缺氧/复氧过程中，心肌组织IL-1β的表达量呈动态的的上升趋势，并与再灌注损伤的程度相一致，因此我们有理由相信大鼠心肌缺氧/复氧过程中IL-1β介导的炎症反应是引起再灌注损伤的重要机制，这对临床上心肌缺血/再灌注损伤的预防与治疗有一定的指导意义。

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Dynamic changes of IL-1β in rat myocardium during hypoxia/ reoxygenation transition

HE Jin-bo, BAO Cai-ying, YE Yu-zhu, LUO Zi-yin, YING Lei, WANG Wan-tie△

(Ischemia/Reperfusion Injury Research Institute, Whenzhou Medical University, Whenzhou 325035, China)

Objective: To investigate the expression profile of interleuki-1β (IL-1β) in rat myocardium at different time points during hypoxia/reoxygenation(H/R)transition. Methods: The isolated Langendorff perfused rat heart model was established．Forty SD rats were randomly divided into sham group (A group) and hypoxia/reoxygenation group (H/R group). The H/R group rats were subdivided into H/R 0.5 h group(B group), H/R 1 h group(C group), H/R 2 h group(D group)according to reoxygenation time. The 1eft ventricular development pressure(LVDP) , maximal rates of increase/decrease of the left ventricular pressure(±dp/dtmax) were continuously recorded．The concentration of interleukin-1β( IL-1β ) and creatine kinase-MB (CK-MB) in myocardium was measured by ELISA. The mRNA expression of IL-1β in myocardium was determined by RT-PCR. Microstructure of myocardium was observed under light microscopy. Results: The value of LVDP and ± dp/dtmaxin hypoxia/reoxygenation group rat were significantly lower than that in sham group(P<0.05). The expression of IL-1β and CK-MB at protein level and the expression of IL-1β at mRNA level in hypoxia /reoxygenation group were higher than that in sham group(P<0.05). There were significant differences of the above parameters among H/R 0.5 h,1 h,2 h group(P<0.05). The concentration of IL-1β and CK-MB, the mRNA expression of IL-1β were higher in H/R 2 h group than that of other groups(P<0.05). Conclusion: The high expression of IL-1β in myocardium after myocardial hypoxia /reoxygenation in rats might lead to.ischemia/reperfusion injury.

IL-1β； myocardial ischemia/reperfusion injury； hemodynamics

R363

A

1000-6834(2015)01-027-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.009