原发性肝癌组织中NFKBIA表达变化及意义

王文杰，任刚，亓久德，刘世海，梁军(莱芜市人民医院，山东莱芜799;青岛大学附属医院)

原发性肝癌组织中NFKBIA表达变化及意义

王文杰1，2，任刚1，亓久德1，刘世海2，梁军2
(1莱芜市人民医院，山东莱芜271199;2青岛大学附属医院)

摘要:目的观察原发性肝细胞癌(肝癌)组织中NFKBIA基因表达变化，并探讨其与肝癌临床病理参数和预后的关系。方法取74例接受手术治疗的肝癌患者的肝癌组织和癌旁正常组织标本，用RT-PCR法检测NFKBIA mRNA表达。用免疫组化法定性检测肝癌组织AFP、Ki-67、Connexin-43表达。分析NFKBIA mRNA表达与患者性别、年龄及肿瘤直径、分化程度、肿瘤包膜完整性、合并肝硬化、合并静脉癌栓、AFP表达、Ki-67表达、Connexin-43表达的关系。比较NFKBIA阳性、阴性患者的中位生存期。结果肝癌组织、癌旁正常组织NFKBIA mRNA表达量分别为1.13±0.78、2.11±1.57，两者相比P＜0.05。肝癌组织NFKBIA mRNA表达与肿瘤包膜完整性有关(P＜0.05)，与患者性别、年龄及肿瘤直径、分化程度、是否伴静脉癌栓、是否伴肝硬化、AFP表达、Ki-67表达、Connexin-43表达无关(P均＞0.05)。NFKBIA阴性患者中位生存时间17个月，短于NFKBIA阳性患者的22个月(P＜0.05)。结论肝癌组织NFKBIA基因表达降低。肝癌组织NFKBIA基因表达与肝癌包膜完整性有关。肝癌组织NFKBIA基因表达阴性提示预后不良。

关键词:肝细胞癌; NFKBIA基因;肿瘤包膜完整性

原发性肝癌(肝癌)是目前世界上第5大常见恶性肿瘤，居常见肿瘤死因的第3位［1］。每年大约有超过60万例新增病例［2］。肝癌手术切除和肝移植治疗已经成为肝癌治疗的主要手段，但手术后肝内复发和远处转移多见。检测和识别影响肝癌预后的分子标志物，可以为肝癌术后患者的治疗方案提供有价值的参考。NF-κB信号通路是肝癌的一条主要信号通路，该信号通路的激活可以导致肿瘤的发生和发展。NFKBIA是NF-κB的抑制因子，可以阻止NF-κB信号通路的激活，但是肝癌组织中NFKBIA的表达情况及其与肝癌临床病理参数的关系尚不明确［3］。为此，2007年1月～2014年1月，我们进行了如下研究。

1　资料与方法

1.1临床资料收集2007年1月～2014年1月于青岛大学附属医院手术切除的74例肝癌患者肝癌组织及癌旁正常组织标本。患者男59例，女15例;年龄33～75岁;肿瘤直径＜5 cm者38例，≥5 cm 者36例;分化程度:高中分化54例，低分化20例;肿瘤包膜完整35例，肿瘤包膜不完整39例;伴肝硬化53例;伴静脉癌栓16例。均经病理检查确诊。所有患者术前均未接受放化疗及免疫治疗。

1.2NFKBIA mRNA检测方法采用实时定量PCR法和2－△△ct法检测肝癌组织和癌旁正常组织中NFKBIA mRNA。严格按照试剂盒说明书操作。NFKBIA引上游引物5'-CTCCGAGACTTTCGAGGAAATAC-3'，下游引物5'-GCCATTGTAGTTGGTAGCCTTCA-3';β-actin上游引物5'-TCATGGGTGTGAACCATGTGAA-3'，下游引物5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'。NFKBIA mRNA表达量F=2－△△ct，△△ct=(待测样品目的基因的ct的平均－待测样本的内参基因的ct的平均－对照样品的目的基因的ct的平均－对照样本的内参基因的ct的平均值)。

1.3AFP、Ki-67和connexin-43检测方法采用免疫组化法检测。主要试剂抗AFP、Ki-67和connexin-43鼠单克隆抗体(ab3980、ab15580、ab11370)，均购自美国Abcam公司，即用型ElivisionTM免疫组化二步法染色试剂盒、DAB显色试剂及其他免疫组化用配套试剂均购自北京中杉公司。按照试剂盒说明书的步骤严格进行操作。80℃烤片1 h，经脱蜡液及梯度酒精脱蜡，抗原修复采用微波修复法;置于3% H2O2灭活内源性过氧化物酶;滴加1∶100比例稀释的一抗，37℃孵育1h;滴加二抗试剂盒试剂，37℃孵育30 min; DAB显色;各步骤间以PBS冲洗3次，每次3 min;复染核、脱水、透明，中性树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照，说明书所附阳性图片作为阳性对照。结果判定光镜下观察整个切片，每例切片随机选取5个高倍镜视野进行结果判定。20%的肿瘤细胞染色强度比周围的结缔组织高则定阳性表达。通过两位经验丰富的病理科医师采用双盲法观察。

1.4随访方法对患者进行电话随访，时间截止于2014年12月。总生存时间的定义为治疗开始至死亡或末次随访时间。

1.5统计学方法采用SPSS17.0统计软件。组间比较采用χ2检验及Fisher精确检验，等级资料用Spearman等级相关分析，生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1肝癌组织和癌旁正常组织NFKBIA mRNA表达肝癌组织、癌旁正常组织NFKBIA mRNA表达量分别为1.13±0.78、2.11±1.56，两组相比P＜0.05。

2.2肝癌临床病理参数与肝癌组织NFKBIA mRNA表达的关系详见表1。肝癌组织中NFKBIA mRNA表达与肿瘤包膜完整性有关(P＜0.05)，与患者性别、年龄、肿瘤直径、分化程度、是否伴静脉癌栓、是否伴肝硬化、AFP表达、Ki-67表达、Connexin-43表达无关(P均＞0.05)。

2.3肝癌组织NFKBIA mRNA表达与患者术后生存期的关系随访截止时死亡56例，存活12例，失访4例，因其他疾病或意外死亡2例。总生存时间6～72个月。NFKBIA阳性、阴性肝癌患者生存曲线见图1。NFKBIA阴性患者中位生存时间17个月，NFKBIA阳性患者中位生存时间22个月，P＜0.05。

3　讨论

NF-κB由Rel区的蛋白家族组成，包括RelA (p65)、RelB、e-Rel、NF-κB1(p50/p105)及NF-κB2 (p52/p100)。至今，NF-κB信号通路在炎症反应、免疫应答及肿瘤发生发展中的功能及作用机制仍是研究热点。NF-κB信号转导途径可通过多种途径抑制细胞凋亡，与Bcl-2家族、IAPs家族、JNK、TRAF家族、FLIP、Gadd45b、A20、MnSOD等分子的调控密切相关［4］;体内、外实验均证明在肿瘤发生过程中NF-κB起着重要作用［5］。

NFKBIA基因位于人类的染色体14q13，包含有三个区域:一个含氮终端，包含信号依赖的调节蛋白降解的磷酸化位点;一个锚蛋白重复序列;一个调节基础降解的碳末端PEST区域。外显子1编码氮末端，这个区域包含的丝氨酸残基是磷酸化的重要位点;锚蛋白重复序列位于外显子2～5;外显子6为碳末端PEST区域。NFKBIA是调控转录因子NF-κB进出细胞核的抑制剂。NFKBIA蛋白包含能与NF-κB蛋白结合的重复锚蛋白为特征。NFKBIA蛋白上Lys-21和(或) Lys-22被磷酸化后的位点特异性泛素化，是激活NF-κB的必要步骤。NFKBIA 与p65/p50二聚体结合后，能够覆盖NF-κB的核定位信号，促使NF-κB在细胞内出现错误定位，无法到达细胞核，从而使p65/p50在胞质中保持静息态。当受到外界因子刺激时，NFKBIA发生磷酸化，与p65/p50解离，使NF-κB的核定位信号暴露而活化。随后，p65/p50二聚体进入细胞核与相应基因的启动子区结合，启动相应基因的的表达［6］。研究发现，在多数正常细胞中NF-κB是处于静息状态的，但是在肿瘤细胞中NF-κB可能持续处于激活状态，持续激活的NF-κB可能调节多种致癌基因，并使多种致癌基因处在持续激活状态，促使致癌基因不断表达，致使癌组织发生、进展及转移［7］。

研究发现，NFKBIA在很多恶性肿瘤中都存在着异常表达，并认为NFKBIA的低表达是恶性肿瘤预后差的一个危险因素。Bredel等［10］报道约25%的恶性胶质瘤组织中存在NFKBIA表达缺失。在NFKBIA缺失的细胞中，如果恢复NFKBIA的表达，则肿瘤的恶性程度降低，对化疗耐药性降低。Masashi等［11］发现肺腺癌组织NFKBIA表达阴性。Sanjmyatav等［12］研究发现有转移的肾透明细胞癌组织中NFKBIA阳性表达率比正常组织低1/4。食管癌组织中NFKBIA亦为低表达［8］。本研究结果显示，肝癌组织中NFKBIA的表达水平明显低于肝脏正常组织，与上述研究结果一致。

本研究结果显示，肝癌组织NFKBIA表达与AFP、ki-67和connexim-43表达无关，生存分析发现，NFKBIA阳性者较阴性者生存时间长，考虑与NFKBIA参与抑制肝癌细胞内的NF-κB信号通路有关。在肝炎、肝纤维化、肝癌中，NF-κB信号转导通路都起着重要作用。肝细胞中NF-κB持续异常激活，将导致胆汁淤积性肝炎和肝癌发生。阻断NF-κB信号转导通路会降低肝脏从慢性炎症发展为肝癌可能性。Elsharkawy等［9］通过阻止异常通路激活和清除相关产物等途径，使肝脏中NF-κB维持在正常生理水平，防止发展为肝癌。同时NFKBIA也参与肿瘤细胞内其他信号通路。Chang等［9］研究发现，NFKBIA可以抑制TGF-β1介导的细胞增殖，而NFKBIA的这种抑制作用与其调控NF-κB无关。研究发现，胞质内NFKBIA非锚蛋白区的C端可与p53的脯氨酸富含区发生相互作用形成p53·NFKBIA复合体，而且这个过程是可逆的，一旦有凋亡、DNA损伤、缺氧及TGF-β1调控的生长抑制作用等情况出现时，胞质中的p53·NFKBIA复合体可以迅速分离，游离的p53可进入到细胞核内发挥相应作用［10］。

本研究结果显示，肝癌组织NFKBIA表达的下调与肝癌包膜的完整性有关。研究已证实，肝癌包膜的形成是肝癌的肿瘤结节和正常肝组织相互作用的结果，肝癌包膜由肝脏的间充质细胞构成，而不是由肝癌细胞构成，完整的肝癌包膜可以阻止肿瘤细胞向正常肝组织的浸润，因此肝癌包膜的完整性与肝癌预后密切相关［11］。肝癌包膜越完整，其细胞分化程度就越高，血供越不丰富，侧支循环也越少［12］。包膜完整者接受肝癌切除术、肝移植手术或经导管化疗栓塞治疗后，容易取得理想的疗效［13］。这可以为临床医师选择合理的治疗方案提供参考。当然，肝癌的发生是一个多因素参与、多途径形成的复杂病理发展过程。NFKBIA在肝癌发生和发展中的作用也同其他信号通路发生联系［14］。正常情况下，大部分信号通路都是正常控制着肝细胞的自我更新和生理预防肝组织急性损伤，然而，当异常持续激活这些信号通路，正常肝细胞可能被转化为肝癌细胞［15］。

总之，NFKBIA的表达与肝癌的发生及恶性生长行为相关，提示肝癌的不良预后，且其可能作为肝癌的标志物，为肝癌靶向治疗提供新的目标基因。

参考文献:

［1］Marquardt JU，Thorgeirsson S S.SnapShot: Hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Cell，2014，25(4) : 550-551.

［2］Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al.Global cancer statistics，2012 ［J］.CA Cancer J Clin，2015，65(2) : 87-108.

［3］Zhao Z，Zhong X，Wu T，et al.Identification of a NFKBIA polymorphism associated with lower NFKBIA protein levels and poor survival outcomes in patients with glioblastoma multiforme［J］.Int J Mol Med，2014，34(5) : 1233-1240.

［4］Madhusoodhanan R，Natarajan M，Veeraraghavan J，et al.NFkappaB activity and transcriptional responses in human breast adenocarcinoma cells after single and fractionated irradiation［J］.Cancer Biol Ther，2009，8(9) : 765-773.

［5］Li J，Gong LY，Song LB，et al.Oncoprotein Bmi-1 renders apoptotic resistance to glioma cells through activation of the IKK-nuclear factor-kappab Pathway［J］.Am J Pathol，2010，176 (2) : 699-709.

［6］Linnewiel-Hermoni K，Motro Y，Miller Y，et al.Carotenoid derivatives inhibit nuclear factor kappa B activity in bone and cancer cells by targeting key thiol groups［J］.Free Radic Biol Med，2014，75(5) : 105-120.

［7］Munoz-Galvan S，Gutierrez G，Perez M，et al.MAP17 (PDZKIP1) expression determines sensitivity to the proteasomal inhibitor bortezomib by preventing cytoprotective autophagy and NF-κB activation in breast cancer［J］.Mol Cancer Ther，2015，35 (4) : 751-753.

［8］Umar M，Upadhyay R，Kumar S，et al.Association of common polymorphisms in TNFA，NFkB1 and NFKBIA with risk and prognosis of esophageal squamous cell carcinoma［J］.PLoS One，2013，8(12) : 81999.

［9］Elsharkawy AM，Mann DA.Nuclear factor-kappaB and the hepatic inflammation-fibrosis-cancer axis［J］.Hepatology，2007，46(2) : 590-597.

［10］Chang NS.The non-ankyrin C terminus of Ikappa Balpha physically interacts with p53 in vivo and dissociates in response to apoptotic stress，hypoxia，DNA damage，and transforming growth factor-beta 1-mediated growth suppression［J］.J Biol Chem，2002，277(12) : 10323-10331.

［11］刘杨安，刘富瑶，张二雷.无肿瘤包膜的肝细胞癌临床病理特征及术后预后分析［J］.华中科技大学学报(医学版)，2013，42(5) : 592-596.

［12］Rimola J，Forner A，Tremosini S，et al.Non-invasive diagnosis of hepatocellular carcinoma≤2 cm in cirrhosis.Diagnostic accuracy assessing fat，capsule and signal intensity at dynamic MRI［J］.J Hepatol，2012，56(6) : 1317-1323.

［13］王珂，汪爱勤，尹文，等.原发性肝癌的治疗进展［J］.山东医药，2014，54(43) : 88-90.

［14］Bredel M，Scholtens D M，Yadav A K，et al.NFKBIA deletion in glioblastomas［J］.N Engl J Med，2011，364(7) : 627-637.

［15］刘强，刘静.肝细胞性肝癌相关分子信号通路的研究进展［J］.世界华人消化杂志，2014，22(3) : 59-66.

Expression changes of NFKBIA in hepatocellular carcinoma and its significance

WANG Wen-jie1，REN Gang，QI Jiu-de，LIU Shi-hai，LIANG Jun
(1 Laiwu City People's Hospital，Laiwu 271199，China)

Abstract:ObjectiveTo explore the expression changes of NFKBIA in the primary hepatocellular carcinoma (PHC) tissues and its relationships with the clinicopathological parameters and prognosis.MethodsThe expression of NFKBIA mRNA in the cancerous tissues and adjacent normal tissues from 74 patients with liver cancer receiving the surgeries was detected by RT-PCR.The expression of AFP，Ki-67 and Connexin-43 in the liver cancer tissues was qualitatively detected by immunohistochemistry.The associations of NFKBIA expression levels with gender，age，diameter of the tumor，differentiation，tumor envelop completeness，liver cirrhosis，tumor thrombus and the expression of AFP，Ki-67 and Connexin-43 were analyzed.Mean survival time (MST) was compared between patients with positive NFKBIA and patients with negative NFKBIA.Results The expression of NFKBIA in the cancer tissues (1.13±0.78) was significantly lower than that in the adjacent normal tissues (2.11±1.56) (P＜0.05).The expression of NFKBIA mRNA in the liver cancer tissues was related with the tumor envelop completeness (P＜0.05)，and was not related with gender，age，diameter，differentiation，tumor thrombus，liver cirrhosis and the expression of AFP，Ki-67 and Connexin-43 (all P＞0.05).The MST of patients with negative NFKFIA expression (17 months) was shorter than that of patients with positive NFKBIA expression (22 months)，(P＜0.05).ConclusionThe expression of NFKBIA decreases in the liver cancer tissues，which may be closely related to tumor envelop completeness.The negative NFKBIA expression predicts the poor prognosis of patients with PHC.

Key words:hepatocellular carcinoma，NFKBIA gene;tumor envelop completeness

(收稿日期:2015-05-10)

通信作者简介:梁军(1959-)，男，博士生导师，主任医师，研究方向为肿瘤综合治疗。E-mail: liangjun818@126.com

作者简介:第一王文杰(1982-)，男，硕士研究生，研究方向为肿瘤综合治疗。E-mail: wangdao@163.com

基金项目:国家自然科学基金资助项目(81372632)。

文章编号:1002-266X(2015) 22-0016-04

文献标志码:A

中图分类号:R735.7

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.22.005