卡维地洛对肝纤维化模型大鼠肝组织瘦素及瘦素受体表达的影响

刘娜，穆华，梁传栋，王玉珍，郑吉敏，张建(河北省人民医院，石家庄050051)

卡维地洛对肝纤维化模型大鼠肝组织瘦素及瘦素受体表达的影响

刘娜，穆华，梁传栋，王玉珍，郑吉敏，张建
(河北省人民医院，石家庄050051)

摘要:目的探讨卡维地洛抑制肝纤维化的效果及机制。方法将36只雄性SD大鼠随机分为对照组6只、模型组10只、治疗1组及治疗2组各10只。模型组和治疗组采用胆总管结扎法建立大鼠肝纤维化模型。治疗1、2组造模成功后48 h开始每天予卡维地洛药液1 mg/kg分2次灌胃，分别用药2、4周;对照组及模型组同时灌等量蒸馏水。实验结束后取各组大鼠肝左叶组织切片，行常规HE染色和Masson三色染色，光镜下观察各组肝脏纤维化情况; Western blot法检测各组肝组织瘦素以及瘦素受体表达; Real-time Q-PCR法检测瘦素及瘦素受体mRNA。结果HE 及Masson三色染色光镜下观察可见，模型组成功建立胆汁淤积性肝纤维化模型，随着造模时间延长肝纤维化程度逐渐加重。治疗1、2组肝脏纤维化程度较模型组减轻，肝脏纤维化分期降低，P＜0.05。治疗2组肝纤维化程度与治疗1组无统计学差异(P＞0.05)。模型组肝组织瘦素、瘦素受体蛋白及mRNA表达量均较对照组升高(P均＜0.05)，治疗1、2组肝组织瘦素、瘦素受体蛋白及mRNA表达量均较模型组降低(P均＜0.05)，两治疗组相比无统计学差异(P ＞0.05)。结论卡维地洛能对肝纤维化有抑制作用;其机制可能为下调瘦素及瘦素受体基因表达。

关键词:肝纤维化;大鼠;卡维地洛;瘦素;可溶性瘦素受体

肝纤维化是各种致病因素引起肝脏实质细胞坏死，细胞外基质异常增多和过度沉积所致。卡维地洛是新一代具有血管扩张作用的非选择性β受体阻滞剂，兼有α1拮抗作用［1］。研究发现，其可通过交感神经受体阻滞作用直接抑制成纤维细胞的增殖，进而阻止细胞外间质的合成。为探讨卡维地洛对肝纤维化的抑制作用及其机制，我们于2014年2月～2015年2月进行了如下研究。

1　材料与方法

1.1材料实验动物:清洁级雄性SD大鼠36只(购于河北医科大学实验动物中心，医动字第04057 号)，体质量150～200 g;按清洁级大鼠的要求饲养，自由进食水。主要试剂和药物:卡维地洛(6.25 mg/片)研碎溶于蒸馏水备用。瘦素抗体和瘦素受体抗体购于武汉博士德生物工程有限公司。逆转录反应体系、SYBR Green Real Master Mix、Trizol试剂盒购自中国北京天根公司; PCR扩增用引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2肝纤维化模型制作及干预将36只大鼠随机分为对照组6只、模型组10只、治疗1组及治疗2组各10只。模型组和治疗1、2组采用胆总管结扎法制作肝纤维化模型［2］。治疗1、2组造模成功后48 h开始每天予卡维地洛药液1 mg/kg分2次灌胃，分别用药2、4周;对照组及模型组同时灌等量蒸馏水。给药结束后各组均无菌条件下切开皮肤进入腹腔，取左叶肝组织3块，各100 mg，备提取RNA和蛋白用;再切取相同部位左叶肝组织5 mm×5 mm ×5 mm，以4%多聚甲醛固定，常规石蜡切片，用于HE染色和Masson染色。

1.3观察项目及方法

1.3.1肝组织病理学变化常规HE染色和Masson三色染色后于光学显微镜下观察肝组织病理学改变，每张切片随机取10个视野。根据肝脏胶原纤维增生程度，按肝纤维化分级标准进行分级。0级:肝组织正常，无胶原纤维增生;Ⅰ级:胶原纤维从汇管区或中央静脉周围轻度向外延伸;Ⅱ级:胶原纤维延伸明显，但尚未相互连接包绕整个肝小叶;Ⅲ级:胶原纤维延伸明显，相互连结，包绕整个肝小叶;Ⅳ级:胶原纤维包绕分割肝小叶，以致正常肝小叶结构破坏，假小叶形成，但以大方形假小叶为主;Ⅴ级:肝小叶结构完全破坏，假小叶形成，大方形假小叶与小圆形假小叶各占50%;Ⅵ级:肝内满布小圆形假小叶，假小叶内有粗大增生的胶原纤维。

1.3.2肝组织瘦素及瘦素受体蛋白表达提取肝组织总蛋白，用考马斯亮蓝比色法测定瘦素及瘦素受体蛋白含量。以8%的SDS-PAGE凝胶作为分离胶电泳，转膜，封闭，分别以兔抗人痩素抗体(1∶200)、兔抗人痩素受体抗体(1∶200)和兔抗人β-Actin多克隆抗体(1∶200)作为第一抗体反应;辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶5 000)作为第二抗体反应。采用ECL发光剂显影、定影，结果以目的蛋白与β-actin的积分光密度值的比值表示。密度扫描分析采用美国Kodak公司ID数码成像分析系统软件对结果进行定量分析，灰度值以积分光密度值(IOD)表示。

1.3.3肝组织瘦素及瘦素受体mRNA表达采用实时荧光定量PCR (Real-time Q-PCR)法。采用TrizoL法提取肝组织总RNA，逆转录合成cDNA;瘦素、瘦素受体及内参照甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物参照Genebank基因序列自行设计，由北京赛百盛基因有限公司合成。引物序列:瘦素正向5'-CAATGACATTTCACACACGCAG-3'，反向5'-AGATGGAGGAGGTCTCGCAG-3'，扩增产物长度204 bp。瘦素受体正向5'-GTGTCCTTCCTGACTCCGTAG-3'，反向5'-GTTATTCTCTGGAAAGACTGGCT-3'，扩增产物长度119 bp。GAPDH正向5'-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3'，反向5'-AGATCCACAACGGATACATT-3'，扩增产物长度259 bp。在PE5700实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)上进行实时定量扩增。SYBR反应体系25 μL。反应条件: 93℃、5 min，1个循环; 93℃、45 s，55℃、1 min，10个循环; 93℃、30 s，55℃、45 s，30个循环。采用实时荧光定量PCR仪自带软件计算获得产物的Ct值。采用相对定量2－△△Ct法计算瘦素、瘦素受体mRNA相对表达量。

1.4统计学方法采用SPSS12.0统计软件。数据以珋x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两组间比较采用q检验。P﹤0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1肝组织病理学变化HE及Masson三色染色光镜下观察可见，模型组胆汁淤积性肝纤维化模型成功建立，随着造模时间延长肝纤维化程度逐渐加重。肝脏广泛纤维结缔组织增生，增生的纤维间隔互相连接、包绕、分割，改建原来的肝小叶甚至形成假小叶。肝纤维化分级对照组为0级、模型组为(3.9±0.7)级、治疗1组为(2.6±0.7)级、治疗2组为(2.4±0.6)级，治疗1、2组肝脏纤维化程度较模型组减轻，肝脏纤维化分期降低，P均﹤0.05。治疗2组低于治疗1组，两组相比无统计学意义。

2.2瘦素、瘦素受体蛋白、mRNA表达各组肝组织瘦素、瘦素受体蛋白及mRNA表达见表1。由表1可见，模型组肝组织瘦素、瘦素受体蛋白及mRNA表达量均高于对照组(P均＜0.05)，治疗1、2组均低于模型组(P均＜0.05) ;治疗2组与治疗1组相比，差异无统计学意义(P均＞0.05)。

表1　各组肝组织瘦素、瘦素受体蛋白及mRNA表达比较(±s)

注:与模型组相比，*P＜0.05;与对照组相比，#P＜0.05。

组别　n　瘦素蛋白　瘦素受体蛋白　瘦素mRNA瘦素受体mRNA治疗1组　10　2.86±0.10 3.24±0.13*2.58±0.09*2.46±0.11*治疗2组　10　2.34±0.09*2.37±0.11*1.84±0.12*1.95±0.07*模型组　10　3.24±0.12#4.53±0.15#3.57±0.08#3.95±0.06#对照组6　1.23±0.09 1.42±0.10　1.00±0.08　1.00±0.09

3　讨论

瘦素是重要的脂肪因子，其生理作用主要是通过抑制食欲、促进外周的脂肪分解及抑制脂肪的合成来调节体脂肪的稳定［3，4］。此外瘦素还参与肝脏对脂质代谢的调节作用，近年来瘦素在非酒精性脂肪肝、慢性丙型肝炎及肝硬化等肝病中的作用已引起众多学者的关注［5，6］。研究发现，非酒精性脂肪肝患者血清瘦素水平明显升高，并与病变程度呈正相关。可溶性瘦素受体是主要的瘦素结合蛋白，影响游离瘦素指数，调节瘦素的生物活性。非酒精性脂肪肝患者血清可溶性瘦素受体水平明显降低，提示可能与体内存在瘦素抵抗有关。瘦素还可显著促进肝脏主要纤维生成细胞肝星状细胞(HSC)的细胞增殖，并抑制HSC的细胞凋亡［7］。

研究证实，交感神经系统过度活化参与了肝脏损伤后修复和纤维化的调节，交感神经系统通过其神经递质去甲肾上腺素(NE)对HSC增殖和凋亡等细胞行为的调节，影响肝脏纤维化的发生和发展［8］。HSC可以合成和释放NE，并表达α1、β1、β2等肾上腺素受体。随着肝纤维化的进展，各肾上腺素受体蛋白及mRNA含量明显增加［9］。NE还可抑制体外培养HSC的凋亡，并促进其增殖，从而促进肝纤维化的形成;加入NE受体阻滞剂于体外培养的HSC，细胞凋亡明显增加［10］。动物实验发现，低儿茶酚胺水平或低交感活性的痩素缺陷性ob/ob小鼠可产生肝纤维化抵抗;给予小鼠肝细胞毒性饮食，NE缺乏者不能出现活化HSC的积累，纤维化形成过程减慢;而补充促肾上腺素释放物质时，这种现象消失。NE直接作用于HSC，调节并削弱瘦素对HSC的活化［11］。由此可见，瘦素对肝纤维化的调节作用可能需要交感神经系统的参与。

卡维地洛是第三代β阻滞剂，除具有非选择性阻断β受体外，还可选择性地阻断α1受体，并具有抗氧化、抗增生及抑制细胞凋亡等功能。卡维地洛可能通过其交感神经受体阻滞作用直接抑制成纤维细胞的增殖，进而阻止细胞外间质的合成，减轻心脏间质重塑、预防心力衰竭的发生发展。目前卡维地洛广泛应用于心血管领域［12］，在肝纤维化方面的研究也屡见报道。本研究模型组肝组织瘦素及瘦素受体蛋白、mRNA表达明显升高，说明瘦素确实参与了肝纤维化的进程。治疗组卡维地洛灌胃后肝纤维化程度减轻，肝纤维化分级明显改善，肝组织瘦素蛋白及mRNA表达明显降低。证实卡维地洛可抑制肝纤维化的发生及发展;其机制可能是阻断交感神经系统的经典神经递质NE与其特定肾上腺素能受体相结合，进而影响瘦素以及瘦素受体表达。

参考文献:

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Effect of carvedilol on expression of leptin and leptin receptor in liver fibrosis rat models

LIU Na，MU Hua，LIANG Chuan-dong，WANG Yu-zhen，ZHENG Ji-min，ZHANG Jian
(Hebei General Hospital，Shijiazhuang 050051，China)

Abstract:Objective To investigate the effect and mechanism of carvedilol on inhibition of liver fibrosis.Methods Thirty-six male SD rats were randomly divided into groups: the control group (n=6)，model group (n=10)，the carvedilol treatment group 1 (n=10) and the carvedilol treatment group 2 (n=10).Liver fibrosis rat models were established through common bile duct ligation.After the models were accomplished for 48 hours，the rats of treatment groups 1 and 2 were gavaged with carvedilol 1 mg/kg twice a day for 2 weeks and 4 weeks.The rats in the control group and model group were gavaged with equal quantity distilled water at the same time.After the experiments，liver tissue sections were prepared from left lobe of liver，routine HE staining and Masson trichrome staining were used to observe the liver fibrosis in each group.The expression of leptin and soluble leptin receptor (sOB-R) in the liver tissues of each group was detected by Western blotting，and the mRNA expression of leptin and leptin receptor was detected with real-time Q-PCR.Results HE and Masson trichrome showed，cholestatic liver fibrosis rat model was successfully established.The degree of liver fibrosis aggravated gradually as the molding time extension.The liver fibrosis in the carvedilol treatment group 1 and group 2 was decreased significantly as compared with that of the model group，and the pathological stage of liver fibrosis reduced significantly as compared with that of the model group (P＜0.05).No statistically significant difference was found between treatment group 1 and treatment group 2 (P＞0.05).The protein and mRNA expression of leptin and sOB-R in the rat liver tissues of the model group was significantly higher than that of the control group (all P＜0.05).The protein and mRNA expression of leptin and sOB-R in the rat liver tissues of the carvedilol treatment groups 1 and 2 was significantly decreased as compared with that of the model group (all P＜0.05)，but the differences between treatment group 1 and treatment group 2 was not statistically significant (P＞0.05).ConclusionCarvedilol can inhibit the process of liver fibrosis，whose mechanism may be the down-regulation of the expression of leptin and sOB-R in the liver tissues.

Key words:hepatic fibrosis; rats; carvedilol; leptin; soluble leptin receptor

(收稿日期:2015-02-15)

作者简介:第一刘娜(1979-)女，博士，主治医师，研究方向为慢性肝病的治疗。E-mail: 1093961170@ qq.com

文章编号:1002-266X(2015)22-0009-03

文献标志码:A

中图分类号:R575.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.22.003