细胞自噬在原发性肝癌发生与防治中的生物学作用

朱朋飞??秦建民

[摘要] 肝细胞癌是临床常见恶性肿瘤之一，早期诊断困难，手术切除率低，术后复发与转移率高，目前尚无治疗肝癌及其复发与转移的特异方法。细胞自噬是一种细胞自我消化过程，在能量缺乏、外界刺激等压力下，机体将细胞内变性、损伤、衰老或非功能性的蛋白、细胞器和细胞质包裹、消化，降解成为核苷、氨基酸和脂肪酸循环利用，实现细胞自身代谢需要和细胞器的更新，对于细胞生存、分化以及自身稳态的维持具有重要的生物学作用。肝癌细胞依靠细胞自噬作用维持生存和生物学活性，细胞自噬对肝细胞癌产生“保护”或“杀伤”不同作用，深入研究细胞自噬在肝细胞癌发生、发展中出现的双重调控作用，对于揭示肝细胞癌发生、发展机制和防治具有重要的生物学意义。

[关键词] 肝细胞癌；自噬；机制

[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2015）04-24-05

肝细胞癌 （hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见、难治疗的恶性肿瘤之一，全球每年新发肝癌约75万人，而我国作为原发性肝癌的高发区，占据了一半以上，并且随着人们生活习惯与环境改变的影响逐年增高[1]。肝癌在我国恶性肿瘤中居第六位，病死率在所有肿瘤中居第三位，仅次于肺癌和胃癌，每年我国约有13万人死于肝癌[2]。目前对于肝癌的治疗仍是以手术为主，放疗、化疗、消融、免疫和分子靶向药物等治疗为辅，由于肝癌起病隐匿、早期症状不明显，导致早期诊断率低，多数患者就诊时已属中晚期，治愈率低。对于手术治疗的肝癌术后复发率较高，放疗、化疗、免疫、分子靶向药物

等治疗仅能使部分患者获得较满意的疗效，目前尚无特异的治疗方法用于肝癌及其复发与转移的治疗，因此深入揭示肝细胞癌发生、发展的确切机制，是降低肝癌发生率和提高治疗效果的关键所在。

细胞自噬（autophagy）广泛存在于真核生物中，是一种细胞自我消化过程，在能量缺乏、外界刺激等压力下，通过自噬作用，机体将细胞内变性、损伤、衰老或非功能性的蛋白、细胞器和细胞质包裹、消化，降解成为核苷、氨基酸和脂肪酸循环利用，从而实现细胞自身代谢需要和细胞器的更新，细胞自噬对于细胞生存、分化以及自身稳态的维持具有重要的生物学作用[3]。细胞自噬受到相关基因的严格调控，无论是在生理还是病理状态下，自噬对于细胞的作用都是巨大的，特别是在肿瘤细胞中，可以缓解肿瘤细胞增殖带来的代谢压力，但是过度的自噬又会引起细胞的死亡，这种死亡不同于正常的细胞凋亡，它属于细胞自噬性死亡（Ⅱ型程序性细胞死亡）[4-5]。肝癌细胞可以依靠细胞自噬作用维持生存和生物学活性，并为肿瘤的生长提供物质和能量支持，但是细胞自噬亦可抑制肿瘤发生、发展，细胞自噬对肝细胞癌的作用与肿瘤生长阶段、微环境、基因多态性以及其他外界刺激等多种因素相关，从而对肝细胞癌产生“保护”或“杀伤”不同作用。深入研究细胞自噬在肝细胞癌发生、发展中出现的双重生物学调控作用，对于揭示肝细胞癌发生、发展机制和防治具有重要的生物学意义。

1 细胞自噬发生的分子机制

自噬发生分为三个阶段：吞噬泡（phagophore）、自噬小体（autophagosome）和自噬溶酶体（autolysosome）形成。在细胞收到自噬信号的诱导后，粗面内质网无核糖体附着区的脱落双层膜包裹待降解的细胞器、蛋白质等物质，形成一个扁形杯型分隔膜，形成吞噬泡；分隔膜继续延伸可以完全包裹待降解的细胞器、蛋白质等物质，形成自噬小体；然后自噬小体与溶酶体融合，形成自噬溶酶体，细胞器、蛋白质等物质被降解为营养物质。

细胞自噬发生的分子机制极其复杂，其中三个步骤最为关键：（1）Atg1-Atg7-Atg13蛋白复合体的形成：Atg1-Atg7-Atg13蛋白复合体是细胞开始自噬的第一步，这一过程受到雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路的调控，mTOR可以将Atg13磷酸化，从而抑制Atg1-Atg7-Atg13蛋白复合体的形成，进而抑制自噬的发生；（2）Vps34（classⅢ PI-3 kinases）的激活：Beclin-1基因可以激活Vps34，而Vps34和它的产物3-磷酸磷脂酰肌醇（P13-P）有利于吞噬泡的形成；（3）泛素化修饰系统的形成：有两个泛素化修饰系统参与了自噬小体的形成，一个是Atg12-Atg5系统，另一个是Atg8-PE系统。Atg12-Atg5系统中还涉及Atg7和Atg10，Atg7催化Atg12和Atg10结合，然后Atg10将Atg12传递给Atg5，从而使Atg12和Atg5结合，形成Atg12-Atg5复合体[6]。在Atg8-PE系统的形成过程中，首先是Atg8被Atg4水解，使Atg8暴露出氨基乙酸的末端，然后Atg8在Atg3和Atg3的催化作用下与PE结合，最终形成Atg8-PE系统[7]。细胞自噬是在多种信号通路中相关分子修饰激活相互作用过程中发生，其中任何一个环节出现异常，均影响细胞自噬发生。

2 细胞自噬的信号通路调控作用

2.1 PI3KⅢ信号通路

beclin-1基因在自噬的调控中具有重要的生物学作用，它编码的抑癌蛋白可以与Ⅲ型磷酸肌醇三磷酸激酶（PI3KⅢ）形成复合体，当激活PI3KⅢ后，PI3KⅢ催化底物形成3-磷酸磷脂酰肌醇（PIP），PIP可以促进细胞自噬[7]。李子东等[8]研究发现当细胞缺乏营养时激活PI3KⅢ，形成beclin-1/ PI3KⅢ复合体，从而调控细胞自噬。另外紫外线辐射电阻相关基因（UVRAC）、Bif-1（bax interacting factor1）、B细胞淋巴癌2基因（Bcl-2）参与细胞自噬，UVRAC与Bif-1属于抑癌蛋白，可以激活PI3KⅢ，协同beclin-1与PI3KⅢ相互作用，从而激活自噬；而Bcl-2可以与beclin-1形成二聚体，抑制beclin-1对自噬的调节作用[9-10]。Thoresen等[11]研究发现3-甲基腺嘌呤（3-MA）对自噬的抑制作用是通过对PI3KⅢ激活而发挥作用。因此当PI3KⅢ信号通路相关基因功能异常激活或抑制，通过影响PI3KⅢ复合体形成调控细胞自噬发生。

2.2 mTOR信号通路

mTOR存在两种复合形式，分别为mTORC1、mTORC2，其中mTORC1对细胞自噬产生影响。Nicklin等[12]研究发现细胞内亮氨酸增多时，活化GTPases和MAP4K3，从而激活mTORC1促进细胞自噬。Han等[13]研究发现脑组织同源类似物（Rheb）和小三磷酸鸟苷酶通过激活mTOR抑制细胞自噬，而TSC-1和TSC-2复合物抑制GTP酶和Rheb，进而抑制mTOR活性促进细胞自噬。另外研究显示TSC-2分别被Akt和AMPK磷酸化，当被Akt磷酸化时，激活mTOR抑制自噬，被AMPK磷酸化时抑制mTOR的活性而促进细胞自噬。当细胞缺乏能量时，ATP/AMP下降引起AMPK激活，抑制mTOR活性而促进细胞自噬[14]。mTOR信号通路中mTOR的活性状态在细胞自噬中具有重要的生物学作用，任何影响mTOR信号通路中mTOR的活性因素能够调控细胞自噬。

2.3 PI3K/Akt信号通路

PI3K有Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型结构形式，与细胞自噬有关的主要是Ⅰ型PI3K和Ⅲ型PI3K，其中Ⅲ型PI3K促进细胞自噬，而Ⅰ型PI3K抑制自噬[15]。研究发现p27通过激活细胞周期蛋白（CDK）活性，促进细胞增殖；而p27激活需要Akt参与，当Akt活性降低时，影响p27激活，从而抑制细胞增殖，诱导细胞自噬发生。在PI3K/Akt通路中，磷酸酶及张力蛋白同源基因（PTEN）通过抑制PI3K和Akt激活而促进细胞自噬[16-17]。

3 细胞自噬在肝癌发生发展中的作用

自噬在肿瘤的不同时期发挥着两种相反的作用，促进或者抑制肿瘤的生长。在肿瘤发生的早期，自噬可以通过破坏肿瘤细胞的细胞器或者大分子物质这种方式来抑制肿瘤细胞的增殖，然而由于肿瘤细胞大量增殖，肿瘤细胞需要大量营养与氧气的支持，此时血管尚未形成，通过自噬降解细胞器和蛋白质为肿瘤细胞提供营养物质，促进肿瘤细胞的增长，另外自噬还可以保护肿瘤细胞免受放疗或者化疗损害，促进肿瘤细胞增殖[18-20]。温莹浩等[21]通过二乙基亚硝胺诱导原发性肝癌模型，结果发现肝癌组织和癌前结节自噬能力较正常肝细胞下降，正常肝细胞经种植瘤大鼠腹水作用后自噬性蛋白降解被完全抑制，而且从肝结节和肝细胞肝癌中分离出的自噬液泡溶酶体活性较低。Ding等[22]研究发现肝癌组织中自噬相关蛋白Beclin 1的表达明显低于周围正常组织，且Beclin 1表达水平与肝癌的恶性程度相关，在同时进行细胞试验中同样证明了Beclin 1的表达在肿瘤细胞中明显低于正常细胞，且与肿瘤细胞的侵袭和转移能力相关。任宁等[23]通过体外培养肝癌细胞研究发现自噬对肝癌HepG-2 细胞增殖有抑制作用，自噬不利于肝癌HepG2 细胞成活，肝癌HepG-2 细胞自噬的发生多停留在细胞周期的G1期。因此细胞自噬对肝细胞癌的作用与肿瘤发生发展的阶段、微环境、基因多态性以及其他外界刺激等多种因素相关，从面对肝癌细胞产生“保护”或“杀伤”的不同作用，只有针对细胞自噬在肝细胞癌不同发展阶段调控关键分子进行有效干预，使细胞自噬产生抑制肝癌细胞增殖作用，才能达到防治肝癌的效果。

4 针对细胞自噬的中西医方法治疗肝癌

4.1 西药对肝癌细胞自噬的影响

在缺乏营养及氧气时，肝癌细胞依赖细胞自噬获得营养，同时主动向营养丰富的地方迁移，抑制细胞自噬不仅减少细胞自噬对肝癌的保护作用，而且抑制肝癌细胞增殖和迁移[24-25]。精氨酸是肝癌细胞增殖必需的氨基酸，但肝癌细胞不能自我合成，必须从外界摄取。Glazer等[26]应用聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶（ADI-PEG20）分解环境中的精氨酸，营造精氨酸缺乏的环境，能够促进细胞自噬，导致肝癌细胞死亡。孙广涛等[27]应用索拉菲尼作用于肝癌细胞HepG2，结果发现不同水平的自噬对肝癌细胞作用不同，基础水平的自噬对肝癌细胞有一定的保护作用，而过量的自噬表达促使肝癌细胞死亡。李媛媛等[28]应用奥沙利铂诱导肝癌细胞HepG2自噬功能，诱导肝癌细胞自噬体形成增加，而且不同靶点的自噬抑制剂（3-甲基腺嘌呤或氯喹）均明显增加奥沙利铂对肝癌细胞的生长抑制作用，增强奥沙利铂对肝癌细胞的杀伤作用。杜鹏等[29]通过雷帕霉素阻断雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路，诱导肝癌细胞HepG2细胞自噬发生，联合表阿霉素时能增加自噬水平，提高HepG2细胞对化疗敏感性。Zhang等[30]研究发现SB203580通过诱导AMPK和P53磷酸化，抑制DAPK磷酸化，激活AMPK和DAPK信号通路，从而促进肝癌细胞自噬，抑制肝癌细胞增殖。杜海磊等[31]研究发现索拉非尼可诱导肝癌细胞HepG2产生细胞自噬及活性氧（ROS），导致自噬相关基因Beclin-1 mRNA和蛋白水平表达增加，抑制ROS的产生能够减少索拉非尼诱导肝癌细胞HepG2自噬的表达量，表明抑制自噬增强了索拉非尼对肝癌细胞的抑制作用，索拉非尼在抑制肝癌细胞自噬过程中自噬可能起到保护作用。范文洁等[32]研究发现褪黑素（MT）在杀伤肝癌细胞时，同时激活细胞自噬保护肝癌细胞，用3-甲基腺嘌呤或氯喹抑制细胞自噬后，MT对肝癌细胞的杀伤作用明显增强，表明联用自噬抑制剂抑制细胞自噬能够增强MT对肝癌细胞的治疗作用。

4.2 中医药对肝癌细胞自噬的影响

近年来研究发现许多中药单体或复方制剂通过诱导肿瘤细胞自噬，抑制肝癌细胞增殖，改善肝癌患者预后。如珊瑚内分离出的倍半萜类化合物Hirsutanol A，Hirsutanol A通过提高ROS，诱发肝癌细胞自噬，苦参碱在细胞周期G1期诱导肝癌细胞发生自噬，从而抑制肝癌细胞的增殖[33-34]。王威等[35]研究发现葡萄籽原花青素不仅可以抑制肝癌细胞增殖，而且随原花青素浓度增加，肝癌细胞LC3-Ⅱ蛋白表达增加，表明原花青素通过诱导细胞自噬抑制肝癌细胞增殖。朱茉莉等[36]研究发现槲皮素能明显抑制人肝癌SMMC-7721细胞的生长，并诱导其发生自噬，自噬激活能降低槲皮素对SMMC-7721细胞的毒性，自噬的发生与溶酶体酶组织蛋白酶B表达增强相关。朱传升等[37]体外应用三氧化二砷作用于人HepG-2肝癌细胞，发现三氧化二砷可诱导HepG-2细胞自噬，自噬和凋亡同时存在抑制肝癌细胞增殖，诱导HepG-2细胞自噬的机制可能与下调Bcl-2基因表达有关。张武德等[38] 应用扶正抑瘤汤作用肝癌细胞后，发现其可以激活肝癌HepG-2细胞Beclin1、Bnip3、LC3表达，诱导肝癌细胞自噬，抑制肝癌细胞增殖。丁向萍等[39]应用复方虫草作用于人肝癌HepG-2细胞，结果发现此复方制剂抑制肝癌细胞增殖作用主要是通过细胞自噬，导致细胞浆空泡变性，胞浆内容物降解，轻度的染色质浓缩，明显改变细胞周期，阻滞细胞于S期，细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻，膜结构发生改变，其诱导细胞自噬作用机制主要与抑制端粒酶活性、下调Survivin、NF-κB、p65及bcl-2蛋白的表达有关。细胞自噬在中医药抗肝癌治疗中具有重要的生物学作用，通过深入研发中药单体针对性地影响细胞自噬，能够极大地提高药物治疗肝癌的疗效。

细胞自噬在肝癌发生、发展与治疗中具有重要的生物学作用，细胞自噬在肝癌不同发展阶段可使肿瘤细胞自噬性死亡，抑制肿瘤的生长；自噬亦可以吞噬破坏细胞器、蛋白，增强肿瘤细胞抵抗恶劣环境的能力，保护肿瘤细胞。自噬对肝癌具有保护或抑制双重作用，但其作用机制尚未完全阐明，相信不久的将来，随着进一步深入研究，阐明自噬发生的调控机制，针对关键环节进行干预，不仅能够控制肝癌发生、发展，而且减少肿瘤对抗癌药物的耐药性，研发针对自噬治疗肝癌的靶向药物，造福于广大的肝癌患者。

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（收稿日期：2014-10-24