IL-33对大鼠I/R损伤心肌炎症反应和细胞自噬的影响

马瑞松，李元红，江洪，胡笑容，李雪飞(武汉大学人民医院，武汉430060;恩施土家族苗族自治州中心医院)

IL-33对大鼠I/R损伤心肌炎症反应和细胞自噬的影响

马瑞松1，李元红2，江洪1，胡笑容1，李雪飞1
(1武汉大学人民医院，武汉430060;2恩施土家族苗族自治州中心医院)

摘要:目的探讨IL-33对心肌缺血再灌注(I/R)损伤心肌的保护作用及机制。方法将32只大鼠随机分为假手术组(n=10)、模型组(n=10)、IL-33组(n=6)及IL-33特异性受体(ST2)抑制剂组(anti-ST2组，n=6)。除假手术组外，其余各组采用结扎冠状动脉左前降支法建立I/R心肌损伤模型。假手术组仅麻醉、开胸、穿线，但不结扎。IL-33制模前30 min尾静脉注射IL-33 10 μg，anti-ST2组注射anti-ST2 0.2 mL(1mg/mL)。再灌注4 h后取血清或心肌组织检测各组以下指标:①血清乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)水平:采用分光光度法检测;②心肌组织Th1型炎症因子(TNF-α、INF-γ、IL-6)和Th2型炎症因子(IL-4、IL-5、IL-13)水平:采用ELISA法检测;③心肌组织自噬蛋白LC3和beclin-1相对表达量:采用Western blot法检测。结果①LDH、CK水平:模型组均明显高于假手术组，IL-33组均明显低于模型组，P均＜0.05; anti-ST2组较模型组无统计学差异。②心肌组织炎症因子表达: Th1型炎症因子模型组及IL-33组均明显高于假手术组，IL-33组明显低于模型组，P均＜0.05; anti-ST2组与模型组比较无统计学差异。Th2型炎症因子模型组明显低于假手术组，IL-33组明显高于模型组，anti-ST2组与模型组比较无统计学差异;③心肌组织自噬蛋白LC3和beclin-1相对表达量:模型组明显高于、IL-33组明显低于假手术组; IL-33组明显低于模型组(P均＜0.05) ; anti-ST2组与模型组比较无统计学差异。IL-33与anti-ST2组各观察指标均有统计学差异(P均＜0.05)。结论IL-33可通过抑制细胞过度自噬，减弱Th1型炎症反应，促进Th2型炎症反应而减轻心肌I/R损伤。

关键词:心肌;缺血再灌注损伤;白介素33;细胞自噬;炎症因子

研究证实，炎症反应和细胞自噬在心肌缺血再灌注(I/R)损伤发生发展过程中发挥重要作用［1～4］。IL-33是一种IL-1家族细胞因子，存在于细胞核内，可调控细胞增殖和转录。当细胞凋亡和坏死时IL-33被释放到细胞外，但凋亡细胞中活化的Caspase-3会将IL-33剪切为无生物活性的片段，而完整的IL-33与其特异性受体ST2结合可发挥细胞因子的作用。近期研究证实，IL-33可诱导幼稚型T细胞向Th2细胞分化，加强Th2型炎症反应，减弱Th1型炎症反应;可参与调节细胞自噬［5，6］。但IL-33是否可通过调节炎症反应和细胞自噬影响心肌I/R损伤尚无相关报道。为此，我们于2014年10月～2015年1月进行了如下研究。

1　材料与方法

1.1动物分组与处理SPF级成年雄性SD大鼠32只，体质量200～250 g，购于武汉大学动物实验中心。随机分为假手术组(假手术组，n=10)、缺血再灌注组(模型组n=10)、白介素33组(n=6)、ST2抑制剂(anti-ST2)组(anti-ST2组，n=6)。除假手术组外，其余各组均建立心肌I/R损伤模型: 2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰卧位固定，气管插管，连接动物呼吸机(呼吸频率70次/min，吸呼比1︰1.5，潮气量3～4 mL/100 g)。动物心电图机记录Ⅱ导心电图。于胸骨左缘开胸暴露心室前壁，剪开心包膜;于左心耳与肺动脉圆锥间用小圆针带5-0线穿过左前降支(LAD)下缘，将前降支与一个中间带凹槽的空心乳胶管一起结扎。以心尖部心肌变苍白、心电图Ⅱ导联明显上抬表明缺血成功。缺血30 min，再灌注4 h。假手术组仅麻醉、开胸、穿线但不结扎。IL-33组及anti-ST2组分别于制模前(麻醉后)尾静脉注射IL-33 10 μg、anti-ST2 0.2 mL(1 mg/mL)。

1.2检测项目及方法

1.2.1血清乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)水平采用分光光度法。再灌4 h后各组经颈静脉取血2 mL，3 000 r/min离心15 min，分离血清，－80℃冰箱保存，选用南京建成生物工程研究所试剂盒，按照试剂盒说明书规范操作检测血清LDH和CK。

1.2.2心肌组织Th1、Th2型炎症反应因子表达再灌4 h后，取各组结扎线水平以下的心肌，剪除右心室，锡纸包被后－80℃冰箱冻存。制备心肌组织匀浆，选用南京建成生物工程研究所试剂盒，采用ELISA法按照试剂盒说明书规范操作，检测心肌组织中Th1型炎症反应因子(TNF-α、INF-γ和IL-6)和型炎症反应Th2因子(IL-4、IL-5和IL-13)。结果(pg/mL)用标准曲线法算出。

1.2.3心肌组织自噬蛋白LC3、beclin-1表达采用Western blot法检测。取材方法同1.2.2，检测方法参照文献［9］，根据分子质量配制12%PAGE胶，电泳后转膜，用5%的脱脂奶粉封闭，4℃孵育一抗过夜，用LC3、beclin-1对应的HRP标记的二抗孵育后，ECL显色。以β-actin为内参计算上述蛋白的相对表达量。

1.3统计学方法采用SPSS21.0统计软件。数据以珋x±s表示。组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用Tukey检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1血清LDH和CK各组血清LDH和CK水平见表1。由表1可见，与假手术组比较，模型组血清LDH和CK明显升高(P均＜0.05) ; IL-33组血清CK明显增高(P＜0.05)，LDH差异无统计学意义。与模型组比，IL-33组血清LDH和CK明显降低(P均＜0.05)，anti-ST2组血清LDH和CK有增高趋势，但差异无统计学意义。

2.2心肌组织Th1、Th2型炎症因子表达各组鼠心肌组织Th1型炎症因子TNF-α、INF-γ、IL-6和Th2型炎症因子IL-4、IL-5和IL-13见表2。由表2可见，与假手术组比较，模型组和IL-33组心肌组织TNF-α、INF-γ、IL-6水平明显升高(P均＜0.05) ;与模型组比较，IL-33组心肌组织上述三种炎症因子水平明显降低(P均＜0.05)，anti-ST2组心肌组织上述三种炎症因子表达有增高趋势，但差异无统计学意义。与假手术组比较，模型组心肌组织IL-4、IL-5 和IL-13水平均降低(P均＜0.05) ;与模型组比较，IL-33组心肌组织IL-4、IL-5和IL-13水平均升高(P均＜0.05)，anti-ST2组心肌组织IL-4、IL-5和IL-13水平与模型组比较差异无统计学意义。

表1　各组血清LDH和CK水平比较(±s)

注:与假手术组比较，*P＜0.05;与模型组比较，#P＜0.05;与IL-33组比较，ΔP＜0.05。

组别　n　LDH(U/L)　CK(U/L)假手术组10　857.988±91.148　1 587.000±179.836模型组　10　1 738.856±88.600*　4 194.760±206.029*IL-33组　6　991.716±11.655#　2 704.333±297.295* #anti-ST2组　6　1 809.073±48.105Δ　4 387.657±200.291Δ

表2　各组心肌组织Th1、Th2型炎症因子水平比较(pg/mL，±s)

注:与假手术组比较，*P＜0.05;与模型组比较，#P＜0.05;与IL-33组比较，ΔP＜0.05。

组别　n　Th1 Th2型炎症因子IL-4　IL-5　IL-13假手术组　10　110.107±5.290　276.269±9.502　72.455±7.930　945.370±59.134　723.139±88.099　965.473±27型炎症因子TNF-α　INF-γIL-6 3.834模型组　10　188.820±8.145*　438.230±8.343*　162.119±10.110*　247.720±37.803*　201.609±17.225*165.449±12.407*IL-33组　6　134.636±5.934#　328.496±9.549#　94.527±5.913#　476.320±26.295* #387.003±17.718* #312.966±53.514* #anti-ST2组　6　205.430±5.585Δ　453.681±8.851Δ　167.921±11.461Δ　315.277±31.615Δ　252.973±17.306Δ　179.636±27.056Δ

2.3心肌组织自噬蛋白LC3、beclin-1表达各组心肌组织自噬蛋白LC3、beclin-1水平见表3。由表3可见，与假手术组比较，模型组心肌组织中LC3和beclin-1水平明显升高(P均＜0.05)，IL-33组心肌组织中LC3和beclin-1水平明显降低(P均＜0.05)。与模型组比较，IL-33组心肌组织中LC3、beclin-1水平明显降低(P均＜0.05)，anti-ST2组心肌组织中LC3、beclin-1水平与模型组比较差异无统计学意义。

表3　各组心肌组织自噬蛋白LC3、beclin-1表达比较(相对表达量，±s)

注:与假手术组比较，*P＜0.05;与模型组比较，#P＜0.05;与IL-33组比较，ΔP＜0.05。

组别　n　LC3/β-actin　beclin-1/β-actin假手术组10　0.319±0.071　0.287±0.043模型组　10　0.409±0.075*　0.424±0.063*IL-33组　6　0.178±0.048* #　0.160±0.021* #anti-ST2组　6　0.545±0.096*Δ　0.496±0.071*Δ

3　讨论

研究证实，IL-33可诱导幼稚T细胞分化为Th2型细胞，并可作为Th2细胞的趋化因子促进Th2细胞聚集;还可直接作用于Th2细胞，促进Th2型炎症因子的分泌［7～9］。Li等［5］报道，IL-33可通过抑制Th1型炎症反应(降低INF-γ)、诱导Th2型炎症反应(升高IL-4、IL-5和IL-13)抑制肝脏I/R。Yin等［10］研究发现，IL-33可通过诱导Th2型炎症反应明显延长小鼠心脏移植后心脏的存活时间。本研究结果显示，在心脏I/R过程中，IL-33可通过抑制Th1炎症反应(降低TNF-α、INF-γ和IL-6)，诱导Th2炎症反应(升高IL-4、IL-5和IL-13)达到降低血清LDH和CK水平、保护心肌的目的。这与前期的研究一致。近期有文献报道，IL-33可促进Th1型免疫反应;亦可影响CD+8型抗病毒T细胞的发育［11］。但本研究中未发现IL-33可升高Th1相关炎症因子水平，提示IL-33可能仅在抗肿瘤和抗慢性病毒性疾病时激活Th1型免疫反应［11］，而在心肌I/R中不能激活Th1型免疫反应。

近期大量的研究表明，细胞自噬在心肌I/R中起着非常重要的作用［6，12，13］。心肌I/R导致的ATP耗竭、氧化应激、内质网应激和蛋白降解均可导致心肌细胞自噬。但自噬对心肌I/R的利与弊取决于具体环境，适度激活自噬对心肌细胞有保护作用，但过度激活自噬会造成细胞死亡［12］。目前普遍认为，在缺血阶段适度激活自噬可处理受损蛋白质，是一种细胞自我保护;在再灌注阶段自噬过度激活可加重心肌I/R损伤［12，13］。Matsui等［14，15］的研究表明，心肌I/R阶段自噬过度激活，表现为beclin-1表达升高，Bcl-2表达显著下调，可导致细胞死亡。本研究模型组心肌组织LC3、beclin-1水平明显高于假手术组，提示I/R损伤可导致心肌细胞过度自噬; IL-33组心肌组织LC3、beclin-1水平明显低于模型组，提示IL-33可通过抑制I/R引起的心肌细胞过度自噬，保护心肌。ST2为IL-33特异性受体，anti-ST2可特异性阻断内源性IL-33的作用。本研究结果显示，anti-ST2组和模型组大鼠血清及心肌组织各指标差异均无统计学意义，这可能是内源性IL-33含量低所致。心肌中IL-33由血管内皮细胞及心肌成纤维细胞分泌，含量极低;同时在心肌I/R过程中心肌细胞损伤以凋亡为主，而完整的IL-33在细胞凋亡时，会被活化的Caspase-3剪切为无活性的片段，进一步降低IL-33水平，而极低的IL-33表达水平，不足以表现出心肌保护作用。

关于IL-33的具体作用机制，目前认为可能与Bcl-2和活性氧(ROS)有关。研究证实，饥饿刺激时，Bcl-2可调节beclin-1介导的细胞自噬［16］，ROS也参与调节beclin-1的表达，且抗氧化剂可以明显减少beclin-1的表达［17］。此外，ROS还可通过抑制自噬相关基因4(Atg4)的活性，促进LC3脂质化和激发自噬［18］。IL-33可促进Bcl-2表达［19］，减少ROS生成［20］，而二者进一步调节再灌注阶段LC3、beclin-1的表达。beclin-1是心肌缺血后再灌注阶段调节自噬最重要的蛋白［14，15］。再灌注阶段beclin-1高表达可过度激活自噬，造成细胞损伤;而通过siRNA转染抑制beclin-1的表达可抑制过度自噬保护心肌［21，22］。故我们推测IL-33可通过调控Bcl-2 和ROS的表达调节LC3和beclin-1表达，抑制过度自噬，保护I/R心肌。但其具体机制仍需进一步研究证实。

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Effect of interleukin 33 on inflammation response and autophagy in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury

MA Rui-song1，LI Yuan-hong，JIANG Hong，HU Xiao-rong，LI Xue-fei
(1 Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the protective effect of interleukin 33 (IL-33) on myocardial ischemia-reperfusion (I/R) injury and the mechanism.Methods Thirty-two rats were randomly divided into 4 groups: the control group (n=10)，I/R group (model group，n=10)，IL-33 group (n=6) and anti-ST2 group (n=6).In addition to the control group，the left anterior descending coronary artery ligation method was adopted to establish the myocardial I/R injury model in the other groups (the sham operation group only received anesthesia，open-chest and threading，but not ligation).Rats in the IL-33+ I/R group and anti-ST2+ I/R group were separately injected to the caudal vein with 10 μg IL-33 and 0.2 mL anti-ST2 (1 mg/mL) 30 min before modeling.After reperfusion for 4 h，we obtained the serum or myocardial tissues to detect the following indicators of each group: (1) the serum lactate dehydrogenase (LDH) and creatine kinase (CK) level: using spectrophotometry，(2) Th1 inflammation factors in the myocardial tissues (TNF-α，INF-γ and IL-6) and Th2 inflammatory cytokines (IL-4，IL-5 and IL-3) : using the ELISA，(3) the relative expression of autophagy protein LC3 and beclin 1 in the myocardial tissues: using Western blotting.Results(1) LDH and CK level: the model group was significantly higher than the control group，IL-33 group was significantly lower than the model group (P＜0.05)，and no statistical difference was found between the anti-ST2 group and the model group.(2) the inflammation factor expression in thebook=2,ebook=464myocardial tissues: Th1 type inflammation factor expression: the model group and IL-33 group were significantly higher than the control group，IL-33 was significantly lower than the model group (all P＜0.05)，and no difference was found between the anti-ST2 group and the model group.Th2 type inflammation factor expression: the model group was significantly lower than the control group，IL-33 group was significantly higher than the model group，and no statistical difference was found between the anti-ST2 group and the model group.(3) The relative expression of autophagy protein LC3 and beclin-1 in the myocardial tissues: the model group was significantly higher，IL-33 group was significantly lower than the control group，IL-33 was significantly lower than the model group (all P＜0.05)，no significant difference was found between the anti-ST2 group and the model group.Statistically significant differences were found in all indexes between the IL-33 and anti-ST2 group.Conclusion IL-33 may attenuate myocardial I/R injury by inhibiting the excessive autophagy，weakening Th1 inflammatory response and enhancing Th2 inflammatory response.

Key words:Myocardium; ischemia-reperfusion injury; interleukin 33; autophagy; inflammatory factor

(收稿日期:2015-03-11)

通信作者简介:李元红(1956-)男，博士，主任医师，教授，研究方向为心电生理和冠心病。E-mail: lyholol@ vip.163.com

作者简介:第一马瑞松(1988-)，硕士在读，研究方向为冠心病。E-mail: maruisong@ outlook.com

基金项目:国家自然科学基金资助项目(81370308)。

文章编号:1002-266X(2015)22-0001-04

文献标志码:A

中图分类号:R543.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.22.001