姜黄素对内毒素诱发的小鼠急性肺损伤的保护作用探讨

谷志龙，姜华茂，胡占升(辽宁医学院第一附属医院，辽宁锦州121001)

姜黄素对内毒素诱发的小鼠急性肺损伤的保护作用探讨

谷志龙，姜华茂，胡占升
(辽宁医学院第一附属医院，辽宁锦州121001)

摘要:目的观察姜黄素对脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肺损伤(ALI)的保护作用，并探讨其机制。方法60 只SPF级BALB/C雄性小鼠，随机分为A～F组，每组各10只。A组腹腔注射生理盐水4 mL/次，1次/d，共注射7 d; B组先腹腔注射生理盐水4 mL/次，1次/d，连续注射7 d，第8天腹腔注射LPS 5 mg/kg; C组处理同B组，但在腹腔注射LPS前10～12 h每只小鼠先腹腔注射TLR-4/MD抗体50 μg; D、E、F组分别腹腔注射姜黄素200、150、100 mg/kg，1次/d，连续注射7 d，第8天腹腔注射1次LPS，剂量5 mg/kg。A组第8天、B～F组腹腔注射LPS后4～6 h，于无菌条件下取小鼠肺组织和外周血。采用动态浊度法测血浆LPS水平。取各组小鼠肺组织标本行HE染色，光镜下观察肺组织病理变化。用RT-PCR法检测各组小鼠肺组织标本TLR4 mRNA表达。用Western-blot法检测各组小鼠肺组织标本TLR4蛋白表达。取各组小鼠肺组织标本行免疫组化染色，检测MyD88及NF-κB表达。结果

与A组相比，B组小鼠血浆LPS增高(P＜0.01)，肺组织呈ALI表现，且TLR4 mRNA及蛋白表达上调(P均＜0.01)，MyD88及NF-κB表达上调(P均＜0.01)。与B组相比，D、E、F组小鼠血浆LPS明显降低(P均＜0.01)，肺组织病理损伤程度下降，TLR4 mRNA及蛋白表达下调(P均＜0.01)，MyD88及NF-κB表达下调(P均＜0.01)。结论姜黄素对LPS诱导的小鼠急性肺损伤有保护作用，其主要机制可能与姜黄素抑制LPS-TLR4激活MyD88-NF-κB信号转导通路有关。

关键词:姜黄素;中药;急性肺损伤;脂多糖; Toll样受体4; MyD88蛋白;核因子κB

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.22.002

急性肺损伤(ALI)主要病理特征是在毛细血管内皮及肺泡上皮广泛损伤［1］，发病率及病死率高，目前除对症支持治疗外，尚无特效治疗手段。炎症介质瀑布样释放和ALI发生有着十分密切关系，多项研究［2，3］表明脂多糖(LPS)致ALI主要机制是LPS通过与Toll样受体(TLR) 4结合，激活单核巨噬细胞，释放大量炎性介质及细胞因子，介导肺部失控性炎症反应。中药姜黄素有抑制炎性细胞活性［4～6］、提高机体免疫力、抗肿瘤［7～9］等作用。2015 年1～2月，我们观察了姜黄素对于LPS诱导小鼠ALI的保护作用，并探讨其可能机制。现报告如下。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物SPF级BALB/C雄性小鼠(购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司) 60只，体质量30～35 g。常规饲养，自由进食水。

1.1.2药品和试剂盒内毒素检测试剂盒购自湛江博康海洋生物有限公司。RT-PCR检测试剂盒购自宝生物工程有限公司公司。Western blot试剂盒购自碧云天公司。免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物制品公司。姜黄素及LPS均购自Sigma Aldrich公司。

1.2方法

1.2.1实验动物分组及处理将60只BALB/C雄性小鼠随机分A～F组，每组10只。A组腹腔注射生理盐水4 mL/次，1次/d，连续注射7 d; B组先腹腔注射生理盐水4 mL/次，1次/d，连续注射7 d，第8天腹腔注射LPS，剂量5 mg/kg; C组处理同B组，但在腹腔注射LPS前10～12 h每只小鼠先腹腔注射TLR-4/MD抗体50 μg; D、E、F组分别腹腔注射200、150、100 mg/kg姜黄素，1次/d，共注射7 d，第8天腹腔注射1次LPS，剂量5 mg/kg。A组第8天、B ～F组腹腔注射LPS后4～6 h，于无菌条件下取小鼠肺组织和外周血待测。

1.2.2检测指标和方法

1.2.2.1血浆内毒素水平分离各组小鼠外周血标本的血浆，用血浆细菌内毒素检测试剂盒(动态浊度法)检测血浆内毒素水平。操作按试剂盒说明书进行。

1.2.2.2肺组织形态学观察将各组小鼠肺组织用4%甲醛固定，经浸润、脱水，二甲醛，石蜡包理，连续切片5张，厚度6 μm，HE染色光镜下观察。用Gloor［10］方法行病理损害评分。

1.2.2.3肺组织TLR4 mRNA表达取各组小鼠肺组织标本80～100 mg，采用RT-PCR法检测其中TLR4 mRNA表达。操作按试剂盒说明书进行。TLR-4上游引物序列: 5'-AATCTGGTGGCTGTGGAG-3';下游: 3'-TCTGGTTCGGAAAGTCCC-5'，扩增产物长度为287 bp;β-actin上游引物序列: 5'-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3';下游: 3'-CCTTTAGCACGCACACTGTA-5'，扩增产物长度为516 bp。反应体系: MgCl22 μL、10×RT Buffer 1 μL、dNTP Mixture 1 μL、Oligo dT 0.5 μL、AMV逆转录酶0.5 μL、RNase Inhibitor 0.25 μL、RNase Free dH2O 3.75 μL、Total RNA 1 μL。反应条件: 31℃10 min，49.3℃30 min，98℃5 min，4℃5 min。以ATLR4与β-actin的比值表示肺组织TLR4 mRNA相对表达量。

1.2.2.4肺组织TLR4蛋白表达采用Western blot法。按试剂盒说明书操作。用Tannon Gis软件计算肺组织TLR4蛋白相对表达量。以ATLR4和β-actin的比值表示肺组织TLR4蛋白相对表达量。

1.2.2.5肺组织MyD88和NF-κB表达采用免疫组化法。按试剂盒说明书操作。肺泡壁、肺泡及支气管镜下棕色颗粒为阳性染色; MyD88和NF-κB蛋白相对表达量通过Image pro plus 6.0进行吸光度值测定分析。

1.3统计学方法采用SPSS17.0统计软件。数据以珋x±s表示。组间比较采用单因素方差分析和两两比较的LSD检验。P＜0.01为差异有统计学意义。

2　结果

2.1造模后一般情况A组全部存活，自洁及摄食水量均正常，反应敏捷; B组1只死亡，余小鼠最初活动异常，之后蜷缩、抱团，反应迟钝，停止摄食水，呼吸频率加快，失去自洁能力; C、D、E、F组小鼠全部存活，表现同A组。

2.2各组血浆内毒素水平及肺组织病理学表现各组小鼠血浆内毒素水平见表1。由表1可见，与A组比，B、C组血浆内毒素水平明显升高(P均＜0.01) ; D、E、F组血浆内毒素水平与B组相比显著降低(P均＜0.01)，其中D组最低。与A组相比，B组肺间隔明显增厚并充血，可见肺泡腔水肿及大量中性粒细胞浸润。D、E、F组上述病变明显减轻，表现为中性粒细胞浸润减少，肺泡腔见少量的红细胞及毛细血管轻度扩张。各组肺组织病理学评分见表1。

表1　各组血浆内毒素水平比较(EU/mL，±s)

注:与A组相比，#P＜0.01;与B组相比，*P＜0.01。

组别　n　内毒素(EU/mL)组织病理学评分A组10　7±0.98　1.00±0.52 B组　9　1 160±9.24#　7.89±0.72#C组　10　1 040±9.37#　3.57±0.56#*D组　10　36±1.74#*　3.34±0.48#*E组　10　67±2.34#*　4.74±0.81#*F组　10　85±2.06#*　5.95±0.68#*

2.3肺组织TLR4基因和蛋白表达各组肺组织TLR4 mRNA和蛋白表达量见表2。由表2可见，与A组比，B组肺组织TLR4 mRNA及蛋白表达明显上调(P均＜0.01)。C～F组与B组比，TLR4基因及蛋白表达明显下调(P均＜0.01)，其中D组最低。

表2　各组肺组织TLR4 mRNA及蛋白表达比较(±s)

注:与A组相比，#P＜0.01;与B组相比，*P＜0.01。

组别　n TLR4 mRNA相对表达量　TLR4蛋白相对表达量A组10　0.246 7±0.053 7　0.250 1±0.052 3 B组　9　0.970 3±0.071 4#　0.982 5±0.072 6#C组　10　0.327 4±0.081 5#*　0.359 6±0.072 5#*D组　10　0.303 6±0.061 8#*　0.323 5±0.081 2#*E组　10　0.568 2±0.072 6#*　0.612 5±0.061 4#*F组　10　0.746 2±0.071 4#*　0.762 4±0.025 1#*

2.4肺组织MyD88和NF-kB表达光镜下观察，A组见少量分布的淡棕色颗粒，B组见肺泡壁、支气管和肺泡大片深棕色颗粒; C组较B组棕色颗粒少、颜色浅; D、E、F组见浅棕色颗粒，分布在肺泡及支气管上。各组小鼠肺组织MyD88和NF-κB蛋白表达量见表3。由表3可见，与A组相比，B组小鼠肺组织MyD88和NF-κB蛋白表达明显升高(P均＜0.01)。C～F组与B组比肺组织MyD88和NF-κB蛋白表达明显下降(P均＜0.01)，D组最低。

表3各组肺组织MyD88和NF-κB蛋白表达比较(±s)

3　讨论

ALI是肺泡上皮及肺毛细血管内皮的通透性增加所致的非心源性肺水肿。LPS在ALI发生发展过程中发挥重要作用［11，12］，和预后密切相关。Toll样受体家族(TLRs)有多种同源物，TLR4是内毒素(LPS)受体［13］。感染发生时，免疫细胞识别侵入机体的G－细菌，启动促炎相关反应，转录和激活一系列下游分子如NF-κB、MyD88、TNF-α等，最终引起以TNF-α、MyD88、NF-κB等［14，15］为中心的促炎症因子激活，放大炎症反应，导致多种炎症因子的瀑布样释放，形成第二次生物损伤效应［16］。本研究中B组小鼠腹腔内注射LPS后，肺泡腔内可见炎性渗出和出血，成功建立了ALI动物模型。B组肺组织TLR4 mRNA、TLR4蛋白、MyD88蛋白、NF-κB蛋白表达均上调，提示急性肺损伤的发病机制可能与TLR4、MyD88和NF-κB相关。其机制可能为LPS和TLR4结合后激活下游分子MyD88转录，将信号下传至肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)，活化的TRAF进一步激活NF-κB诱导酶，使其磷酸化并迁移至细胞核内，导致炎性介质和细胞因子如TNF-α、IL-1、IL-4等释放，引起相应的靶器官损害及临床症状。

本研究结果显示，与A组相比，C组小鼠肺组织血浆内毒素水平升高，但肺组织HE染色及免疫组化未见明显病理性ALI改变，肺泡、肺泡壁及支气管未见棕色颗粒染色，MyD88和NF-kB蛋白表达明显下降，提示LPS通过TLR4受体途径导致ALI;用姜黄素处理的D、E、F组小鼠肺组织血浆内毒素水平明显低于B组，说明姜黄素可以有效降低血浆内毒素水平并具有剂量依赖性，机制可能与姜黄素增强吞噬细胞能力，促进RAW264.7细胞分泌进而抑制TNF-α对抗LPS，但尚不明确确切机制。本研究结果显示，D、E、F组小鼠肺组织损伤程度、TLR4 mRNA和TLR4蛋白表达低于B组，并且呈剂量依赖性变化。机制可能通过姜黄素降低血浆内毒素水平，从而抑制其与TLR4受体结合，下调其下游表达，从而减轻细胞因子及炎性介质(MYD88、NF-KB、TNF-α等)对肺组织的损伤，提示姜黄素具有降低血浆内毒素，防治肺损伤作用，可为临床脓毒血症引起的ALI提供新的治疗方向。

综上所述，姜黄素预处理能够降低LPS诱导的ALI，与剂量相关，其可能机制是通过阻断、干扰LPS-TLR4-MyD88-NF-kB-TNF-α信号通路的转导，从而降低炎性介质及细胞因子的过度表达。因此，姜黄素用于治疗ALI具有良好的临床应用价值。

参考文献:

［1］钱桂生.急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征研究现状与展望［J］.解放军医学杂志，2003，28(2) : 97-101.

［2］刘振千，俞森洋，刘岩.急性肺损伤大鼠肺泡内中性粒细胞凋亡的延迟［J］.中国病理生理杂志，2003，19(5) : 636-638.

［3］叶正龙，徐巧莲，邱海波.中性粒细胞凋亡在大鼠急性肺损伤发病机制中的意义［J］.中国急救医学，2004，24(4) : 25-27.

［4］Cui R，Meng XL，Correlation between protection of scutellaria baicalensis extract on rats acute lung injury and cholinergic anti-inflammatory pathway［J］.Chin Tradit Herb Drugs，2012，43(2) : 321-326.

［5］Lian Q，Li X，Shang Y，et al.Protective effect of curcumin on endotoxin induced acute lung injury in rats［J］.J Hua zhong Univ Sci Technolog Med Sci，2006，26(6) : 678-681.

［6］李薇，李海浪.姜黄素对高氧致新生大鼠肺纤维化的保护作用及机制探讨［J］.医学研究生学报，2009，(6) : 574-577.

［7］Siddiqui AM，Cui X，Wu R，et al.The anti-inflammatory effect of curcumin in an experimental model of sepsisis mediated by upregulation of peroxisome proliferator-activated receptor-gammay［J］.CritCare Med，2006，34(7) : 1874-1882.

［8］Shakibaei M，John T，Schulze-Tanzil G，et al.Suppression of NF-kappa B activation by curcumin leads to inhibition of expression of cyclooxygenase-2 and matrix metalloproteinase-9 in human articular chondrocytes: implications for the reatment of osteoarthritis［J］.Biochem Pharmacol，2007，73(9) : 1434-1445.

［9］Yu PJ，Li JR，Zhu ZG，et al.Praeruptorin D and E attenuate lipopolysaccharide hydrochloric acid induced acute lung injury in mice［J］.Eur J Pharmacol，2013，710(1-3) : 39-48.

［10］Gloor B，Blinman TA，Righerg DA，et al.Kuppffer cell blockade reduces hepatic and systemic cytokine levels and lung injury in hemorrgagic pancreatitis in rats［J］.Pancreas，2000，21(4) : 414-420.

［11］Li M，Shen LX，Zhang XY，et al.Protective effects of two anticomplementary proteins on lipopolysaccharide-induced acute lung injury［J］.Chin Pharm Bull，2012，28(4) : 521-526

［12］Medzhitov R.Recognition of microorganisms and activation of the immune response［J］.Nature，2007，449(7164) : 819-826.

［13］陈赛娟，王一煌.Toll样受体和树突状细胞:免疫激活传感器-2011年诺贝尔生理学或医学奖简介［J］.自然，2011，22(6) : 315-321.

［14］Wickelgren I.Immunology: Targeting the tolls［J］.Science，2011，334(6052) : 31.

［15］Zhu T，Wang DX，Zhang W，et al.Andrographolide peotects against LPS-induced acute lung injury by inactivation of NF-kB［J］.PLoS One，2013，8(2) : 56407.

［16］Liu Z，Yang Z，Fu Y，et al.Protective effect of gossypol on lipopolysaccharide-indeced acute lung injury in mice［J］.Inflamm Res，2013，62(5) : 499-506.

Protective effect of curcumin on acute lung injury induced by lipopolysaccharide in mice

GU Zhi-long，JIANG Hua-mao，HU Zhan-sheng
(The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China)

Abstract:Objective To observe the protective effect of curcumin on acute lung injury (ALI) induced by lipopolysaccharide (LPS) in mice and to investigate the mechanism.Methods Sixty BALB/C male mice in SPF grade were randomly divided into groups A，B，C，D，E and F，10 mice in each group.Mice in the groups A，B and C were daily injected with 4 mL normal saline intraperitoneally，once a day and for 7 d; after that，on day 8，mice in the group B were administered with 5 mg/kg LPS for once，and each mouse in the group C was injected with 50 μg TLR-4/MD antibodies 10-12 h before being administered with 5 mg/kg LPS.In the group A，on day 8，the lung tissues and peripheral blood were obtained and in groups B-F，the lung tissues and peripheral blood were obtained 4-6 h after intraperitoneal injection of LPS under the sterile conditions.The peripheral blood plasma was separated to detect the plasma LPS levels.The lung tissue specimen in each group received HE staining，then we observed the pathology changes of the lung tissues.The TLR4 mRNA expression in the lung tissues of each group was detected by RT-PCR，and the TLR4 protein expression in the lung tissues of each group was detected by Western blotting.The specimens of lung tissues received immunohistochemical staining，and then we detected the expression of MyD88 and NF-κB.Results Compared with group A，the plasma LPS was increased (P＜0.01)，lung tissue showed ALI，and TLR4 mRNA and protein expression，MyD88 and NF-κB expression was up-regulated in the group B (all P＜0.01).Compared with group B，the plasma LPS was significantly decreased (all P＜0.01)，the pathology damage of lung tissues declined，TLR4 mRNA and protein expression was down-regulated (all P＜0.01)，MyD88 and NF-κB expression was down-regulated in the groups D，E and F (all P＜0.01).Conclusion Curcu-book=6,ebook=468min has a protective effect on ALI induced by LPS in mice.The mechanism may be related to the inhibition of LPS-TLR4 combination and the activation of MyD88-Nf-kB signal pathway.

Key words:curcumin; acute lung injury; lipopolysaccharide; Toll-like receptor 4; MyD88 protein; nuclear factor-κB

(收稿日期:2015-03-17)

通信作者简介:胡占升(1969-)，男，博士，教授、主任医师，研究方向为多器官功能衰竭等。E-mail: lzguchn@ hotmail.com

作者简介:第一谷志龙(1984-)，男，硕士，医师，研究方向为急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合症。E-mail: lzguchn@163.com

基金项目:辽宁省教育厅科研基金资助项目(2008419)。

文章编号:1002-266X(2015)22-0005-04

文献标志码:A

中图分类号:R563