SIRT1-shRNA慢病毒表达载体转染对A549细胞生物学行为的影响

孙硕文，朱之燕，杜玮，王豪，刘喆(天津医科大学，天津300070;2天津市胸科医院)

SIRT1-shRNA慢病毒表达载体转染对A549细胞生物学行为的影响

孙硕文1，2，朱之燕1，杜玮1，王豪1，刘喆1
(1天津医科大学，天津300070;2天津市胸科医院)

摘要:目的探讨SIRT1-shRNA慢病毒表达载体转染对人非小细胞肺癌A549细胞SIRT1基因表达、黏附能力、迁移能力及E-cadherin、β-catenin mRNA和蛋白表达量的影响。方法构建SIRT1-shRNA慢病毒表达载体，并用其转染A549细胞。对照组转染277空载体，观察组转染277-iSIRT1。用RT-PCR法检测两组细胞SIRT1 mRNA表达，用细胞黏附实验检测两组细胞黏附能力，划痕实验检测细胞迁移能力，RT-PCR法检测细胞内E-cadherin、β-catenin mRNA表达，Western blot法检测细胞内E-cadherin、β-catenin蛋白表达。结果观察组、对照组A549细胞SIRT1 mRNA分别为0.48±0.26、1.00±0.00(P＜0.05)，黏附细胞数分别为(196.6±9.8)、(125.6±9.8)个(P＜0.05)，细胞相对迁移率分别为65%±2%、100%±0(P＜0.05)，E-cadherin蛋白表达量分别为1.27±0.16、1.00±0.00(P＜0.05)，β-catenin蛋白表达量分别为1.24 ±0.13、1.00±0.00(P＜0.05)。结论SIRT1-shRNA慢病毒表达载体可明显下调A549细胞SIRT1表达，提高其下游基因E-cadherin、β-catenin mRNA和蛋白表达量，增强细胞黏附能力，降低细胞迁移能力。

关键词:非小细胞肺癌; SIRT1-shRNA慢病毒表达载体; SIRT1基因; E-cadherin蛋白;β-catenin蛋白;细胞黏附;细胞迁移

肺癌是全世界发病率最高的恶性肿瘤，非小细胞肺癌占所有肺癌的85%，其5年生存率仅有约15%。肿瘤细胞的侵袭和转移是造成肺癌治疗失败的主要原因。沉默信息调节因子2 (Sir2)是一种高度保守、广泛存在的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖的去乙酰化酶。已经在哺乳动物中发现有7个Sir2的同源蛋白，分别为SIRT1～SIRT7。其中SIRT1是可使组蛋白和非组蛋白去乙酰化，从而调节细胞增殖、细胞凋亡、能量代谢和肿瘤发生等［1］。大量研究［2～7］显示，肿瘤组织中的SIRT1蛋白表达明显上调，SIRT1与肿瘤的发生和转移密切相关。但是SIRT1调控肿瘤发生发展的机制仍不明确。2013年7月～2014年6月，我们构建了SIRT1-shRNA慢病毒表达载体，并用其转染非小细胞肺癌A549细胞，观察其对A549细胞生物学行为的影响，并探讨其机制。现报告如下。

1　材料与方法

1.1材料人非小细胞肺癌细胞株A549、Phoenix-293细胞均来自天津医科大学实验室。A549细胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基，37℃、5%CO2培养。Phoenix-293细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养。质粒pSuper.reno.puro (pSRP)和慢病毒包装系统由本校实验室保存，限制性内切酶购自NEB，RPMI 1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购于Hyclone，Trizol试剂、逆转录试剂盒和引物购自Invitrogen，E-cadherin、βcatenin和β-actin抗体分别购自BD Biosciences、Abcam和Millipore，辣根过氧化物羊抗鼠二抗购自Jackson Lab，辣根过氧化物酶羊抗兔二抗购自Bioworld，底物Chemiluminescent HRP Substrate购自Millipore。

1.2实验方法

1.2.1SIRT1-shRNA慢病毒表达载体的构建及转染从Sigma网站上提供的shRNA序列中选取1条特异的SIRT1-shRNA靶序列，合成相应的正义和反义DNA序列。以荧光素酶基因的shRNA-iluc作为对照。正义和反义DNA序列退火后形成双链，与pSRP载体连接，转化入E.coli DH5α细胞中，用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后，得到转化子pSRP-iSIRT1。用EcoRⅠ酶切质粒pSRP-iSIRT1，T4 DNA polymerase补平缺口，纯化后用XhoⅠ酶切DNA片段，与277载体连接，转化入E.coli DH5α细胞中，用BamHⅠ和XhoⅠ酶切鉴定后，得到转化子277-iSIRT1。

待Phoenix-293细胞密度长至80%左右，使慢病毒包装系统pGCL-GFP，pHelper1.0(gag/pol元件)，pHelper2.0(VSVG元件)和PEI试剂，分别与277空载体、277-iSIRT1质粒混合，转染Phoenix-293细胞，转染后24 h，收集含有病毒的Phoenix-293细胞上清液。待A549细胞密度长至60%～70%，弃去培养液。对照组、观察组分别加入277空载体、277-iSIRT1转染Phoenix-293细胞的上清液，12 h后更换为正常培养基。显微镜下观察细胞有绿色荧光后，收集总RNA或总蛋白。观察组和对照组每组6孔进行实验。

1.2.2SIRT1 mRNA检测采用PCR法。将转染SIRT1-shRNA慢病毒表达载体的A549细胞中的培养液弃去，加入Trizoll mL，室温放置5 min，加入氯仿200 μL，用力震荡1 min，室温放置5 min; 4℃下12 000 g离心10 min，吸取上清500 μL至新的1.5 mL离心管;加入－20℃预冷的异丙醇500 μL，混匀后沉淀10 min; 4℃、12 000 g离心10 min，去上清;加入4℃预冷的75%乙醇1 mL，洗涤沉淀; 4℃、12 000 g离心5 min后，弃上清;加入RNase-free的水50 μL，至完全溶解。mRNA逆转录:用逆转录试剂盒将mRNA转录为cDNA。PCR反应: 95℃变性5 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，28个循环。SIRT1正向序列: 5'- TGAAAGTGATGAGGAGGATAGAGCC-3'; SIRT1反向序列: 5'-CAACCTGTTCCAGCGTGTCTATGT-3'; GAPDH正向序列: 5'-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3'; GAPDH反向序列: 5'-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTIGT-3'。

1.2.3E-cadherin、β-catenin mRNA检测采用Real-time PCR方法。提取两组细胞总的RNA并逆转录，方法同上。将cDNA稀释后加入Real-time PCR反应体系中，PCR反应条件为50℃2 min，95 ℃2 min，95℃30 s，60℃1 min，40个循环。E-cadherin正向序列: 5'-ACACTGCCAACTGGCTGGAGATTA-3'; E-cadherin反向序列: 5'-TGATTAGGGCTGTGTACGTGCTGT-3';β-catenin正向序列: 5'-GTTGAGCACCTGTTTGCCTGAAGT-3';β-catenin反向序列: 5'-TCAGGTTTGATCCCATCTTCCGCA-3'; GAPDH正向序列: 5'-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3'; GAPDH反向序列: 5'-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3'。待测基因相对表达量采用2－ΔΔCT法计算。待测基因表达量=2－ΔΔCT。ΔΔCT=待测基因的ΔCT－GAPDH的ΔCT。

1.2.4E-cadherin、β-catenin蛋白检测采用Western blot方法。将两组A549细胞培养液弃去，加入100μL蛋白裂解液，将细胞置1.5 mL离心管中，超声破碎至细胞不再黏稠; 100℃、10 min使蛋白变性。蛋白样品上样，10%聚丙烯酰胺凝胶100 V电泳，直至上样缓冲液跑到胶外; 200 mA恒流蛋白转移膜; 5%脱脂牛奶封闭2 h;一抗4℃过夜;二抗室温孵育2 h后，曝光。内参蛋白为β-actin，使用Quantity One 4.2软件比较蛋白条带的灰度值。待测蛋白表达量=待测蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值。

1.2.5细胞黏附能力检测用纤维连接蛋白(终浓度10 ng/mL)包被处理好的盖玻片，置于6孔板中4℃过夜;分别取两组对数生长期细胞5×105接种置于已包被Fibronectin的盖玻片上，15 min后用冰PBS终止反应，再用PBS轻轻洗一遍;用冰4% PFA固定5～10 min，PBS洗两遍。用结晶紫染色，四倍显微镜下每个孔计数5个视野的黏附细胞数，取其均值进行统计学处理。

1.2.6细胞迁移率测算行细胞划痕实验。两组分别取对数生长期细胞接种到6孔板中;当细胞长至90%左右且为单层贴壁生长时，用10 μL枪头在单层细胞上垂直划过;用PBS洗2次后继续培养，60 h后在倒置显微镜下观察伤口愈合情况，并计算迁移率;细胞迁移率=(原划痕宽度－现划痕宽度)/原划痕宽度。

1.2.7统计学方法采用SPSS11.5统计软件。计量资料用珋x±s表示。定量数据资料分析使用独立样本t检验。率的比较用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1SIRT1 mRNA表达观察组、对照组的SIRT1 mRNA表达量分别为0.48±0.26、1.00±0.00，P＜0.05。

2.2细胞黏附能力观察组、对照组的黏附细胞数分别为196.6±9.8、125.6±9.8，P＜0.05。

2.3细胞迁移能力观察组、对照组的相对迁移率分别为65%±2%、100%±0，P＜0.05。

2.4β-catenin、E-cadherin mRNA及蛋白表达观察组、对照组E-cadherin mRNA表达量分别为3.63 ±1.48、1.00±0.00;β-catenin mRNA表达量分别为1.53±0.12、1.00±0.00。观察组明显高于对照组(P均＜0.05)。观察组、对照组E-cadherin蛋白表达量分别为1.27±0.16、1.00±0.00;β-catenin蛋白表达量分别为1.24±0.13、1.00±0.00。观察组明显高于对照组(P均＜0.05)。

3　讨论

SIRT1是一个含有747个氨基酸的蛋白质，包含两个核定位信号和两个出核信号调节其氨基酸序列［11］。SIRT1定位于细胞核中，但在神经分化、轴突生长、肿瘤发展和细胞凋亡的过程中穿梭到细胞质中。在细胞核中SIRT1的主要功能为脱乙酰化组蛋白H3和抑制细胞调亡，在细胞质中的具体作用尚不了解，有研究推测SIRT1穿梭到细胞质中可能会使其细胞核内的靶蛋白去乙酰化水平提高，从而改变活性，影响其胞内功能［12］。由于具有这种核浆穿梭的功能，使SIRT1在调控细胞增殖、应激反应及肿瘤发生等方面具有显著的作用。然而对于SIRT1是促癌基因还是抑癌基因仍然有争论。一方面，SIRT1可以下调多种抑癌基因(如p53)，促进肿瘤的发生［13］。另一方面，SIRT1可以去乙酰化NF-κB 的RelA/p65亚基，从而抑制转录，促进TNF-α诱导的细胞凋亡［14］。

肿瘤转移是指癌细胞从原发灶脱离向其他组织器官侵袭的过程，其关键步骤被认为是上皮细胞间充质转化(EMT)，即上皮细胞改变其表型和形态特征向间充质细胞转化的过程。这些变化导致细胞黏附力降低，细胞迁移能力增强，遗传和表观遗传学改变以及上皮细胞标志蛋白E-cadherin和β-catenin表达量降低。本研究中我们构建了SIRT1-shRNA慢病毒表达载体并用其转染A549细胞，发现A549细胞中SIRT1的表达降低，导致细胞的黏附能力升高，迁移能力下降，E-cadherin和β-catenin的表达量增高，说明降低SIRT1可阻止肿瘤细胞发生EMT改变，从而抑制了非小细胞肺癌的发生与转移。

E-cadherin是一种重要的细胞黏附分子，在生理条件下调节黏附反应，维持组织结构形态和完整性，并维持细胞极性和参与分化的调节［15］。β-catenin是一种具有多重功能的蛋白，能够介导细胞间黏附，并能调控基因表达。β-catenin作为黏附复合体的一个亚基，在经典Wnt信号传导途径中起到重要作用。当Wnt途径被激活后，β-catenin将不能被磷酸化降解，胞质中游离的β-catenin升高，进入细胞核，与Tcf/Lef结合并形成复合体调控核内基因的表达，诱导MMP2、MMP9等基因的转录促进了肿瘤的侵袭和转移［16，17］。因而，β-catenin基因被认为是原癌基因。E-cadherin、α-catenin和β-catenin一起组成E-cadherin/catenin复合体，该复合体胞内结构与细胞骨架蛋白结合，胞外结构介导细胞与细胞、细胞与基质的黏附。E-cadherin的丧失或表达下调会诱导肿瘤细胞发生上皮间质转化，促进了上皮来源肿瘤细胞发生迁移［18］。

下调A549细胞SIRT1表达后虽然β-catenin表达量上升，但是细胞的迁移能力仍然降低，这可能是由于β-catenin被过量的E-cadherin结合并固定于细胞膜上，导致其核内的调控基因表达的功能未能发挥。

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Effect of SIRT1-shRNA lentiviral expression vector transfection on biological behavior of non-small-cell lung cancer A549 cell line

SUN Shuo-wen1，ZHU Zhi-yan，DU Wei，WANG Hao，LIU Zhe
(1 Tianjin Medical University，Tianjin300070，China)

Abstract:Objective To investigate effect of SIRT1-shRNA lentiviral expression vector transfection on the cell adhesion，migration and the expression of E-cadherin and β-catenin in non-small-cell lung cancer (NSCLC) A549 cell line.Methods The SIRT1-shRNA lentiviral expression vector was constructed and we used it to transfect the A549 cells.The cells infected with 277 empty vector were used as the control group and the cells infected with 277-iSIRT1 were used as the observation group.The SIRT1 mRNA expression in the two groups was detected by RT-PCR.Cell adhesion status of A549 cells in the two groups was detected by cell adhesion assay，cell migration was detected by wound healing assay，and the protein and mRNA expression levels of E-cadherin andβ-catenin were detected by RT-PCR and Western blotting，respectively.Resultsthe SIRT1 mRNA of A549 cells in the observation group and control group were respectively 0.48±0.26 and 1.00±0.00 (P＜0.05)，the adhesive cells of the observation group and control group were 196.6±9.8 and 125.6 ±9.8，respectively (P＜0.05)，the relative migration rates of the observation group and control group were 0.65±0.02 and 1.00±0.00，respectively (P＜0.05).and the E-cadherin expression levels of the observation group and control group were 1.27±0.16 and 1.00±0.00 (P＜0.05)，and β-catenin expression levels were 1.24±0.13 and 1.00±0.00 (P＜0.05).ConclusionSIRT1-shRNA lentiviral expression vector may significantly down-regulate the expression of SIRT1 in A549 cells，increase the expression levels of E-cadherin andβ-catenin mRNA and protein，enhance the capacity of cell adhesion and reduce the cell migration ability.

Key words:non-small-cell lung cancer (NSCLC) ; SIRT1-shRNA lentiviral expression vector; SIRT1 gene; E-cadherin protein;β-catenin protein; cell adhesion;cell migration

(收稿日期:2015-01-22)

通信作者简介:朱之燕(1981-)，实验师，研究方向为肿瘤的表观遗传学。E-mail: zhuzhiyan@ tijmu.edu.cn

作者简介:第一孙硕文(1981-)，女，硕士在读，主管技师，研究方向为肿瘤的表观遗传学。E-mail: karen.81@163.com

基金项目:天津市高等学校科技发展基金计划项目(20140602)。

文章编号:1002-266X(2015) 22-0012-04

文献标志码:A

中图分类号:R734.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.22.004