CagA和IL-9在幽门螺杆菌感染伴消化性溃疡和胃息肉患者中的表达及其作用研究

CagA和IL-9在幽门螺杆菌感染伴消化性溃疡和胃息肉患者中的表达及其作用研究

陈周利*

广东省惠州市惠东县人民医院内二科(516300)

*Email: drchenzhouli@163.com

幽门螺杆菌(Hp)感染可引发不同程度的急慢性 胃炎，并且是消化性溃疡(PU)的重要病因之一[1]。此外，尚有研究[2]结果显示Hp感染与胃息肉(GP)的形成有关。细胞毒素相关蛋白A(CagA)是Hp致病的重要毒力因子之一，根据该蛋白是否表达可将Hp分为两种亚型，CagA+Hp较CagA-Hp引起更为严重的炎症反应和胃黏膜损伤。白细胞介素-9(IL-9)是具有多效性免疫功能的细胞因子，可通过刺激黏膜肥大细胞增殖，间接抑制Th17细胞的免疫活性，从而发挥抗炎效应[3]。本研究通过检测Hp感染伴PU和GP患者的血清、胃黏膜CagA、IL-9表达，旨在探讨CagA、IL-9在Hp感染伴PU和GP发生、发展中的作用。

对象与方法

一、研究对象

纳入2013年1月-2014年3月于广东省惠州市惠东县人民医院就诊的Hp感染伴PU患者64例(Hp+PU组)、Hp感染伴PU和GP患者31例(Hp+PU+GP组)，无Hp感染的慢性胃炎患者43例作为对照组。PU、GP、慢性胃炎的诊断均经胃镜结合组织病理学检查证实；Hp感染经胃黏膜组织切片染色和快速尿素酶试验证实，两者均为阳性者确诊为Hp感染。排除患有其他消化道疾病以及其他急慢性疾病的患者。研究方案经广东省惠州市惠东县人民医院伦理委员会批准，入选患者均签署知情同意书。

二、研究方法

1. ELISA法检测血清CagA、IL-9水平：患者清晨空腹采集静脉血3 mL，3 000 r/min离心10 min，吸取血清于-80 ℃保存待测。CagA、IL-9 ELISA试剂盒购自碧云天生物技术研究所，具体操作步骤参照试剂盒说明书。血清CagA抗体>20 U/mL判定为CagA+[4]。

2. 免疫组化SP法检测胃黏膜组织CagA、IL-9表达：内镜下采集患者胃黏膜组织，4%甲醛溶液固定，乙醇梯度脱水，常规石蜡包埋、切片。病理切片按免疫组化SP法常规步骤处理后，加入CagA单克隆 抗体(1∶500)或IL-9单克隆抗体(1∶500)(Santa Cruz公司)孵育，PBS漂洗后加入二抗，再加入链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，显色、复染后脱水、透明、封片，光学显微镜下观察。CagA、IL-9阳性染色为细胞质呈棕黄色至棕褐色。采用全视图测量，选择免疫组化阳性区域，每张切片选取5个视野(×400)，以蔡司Axioplan 2 imaging显微图像分析系统进行图像处理，计算阳性面积比值。

三、统计学分析

结果

一、一般情况

Hp+PU组男40例，女24例，年龄39~67岁，平均(46.7±5.1)岁；Hp+PU+GP组男17例，女14例，年龄36~71岁，平均(49.5±4.6)岁；对照组男20例，女23例，年龄31~66岁，平均(41.4±7.9)岁。三组患者性别构成、年龄差异无统计学意义(P>0.05)。

二、血清CagA、IL-9水平

Hp+PU组、Hp+PU+GP组血清CagA水平均显著高于对照组(P<0.01)，Hp+PU+GP组略高于Hp+PU组，但两组间差异无统计学意义(P>0.05)。Hp+PU组、Hp+PU+GP组血清IL-9水平均显著低于对照组(P<0.01)，Hp+PU+GP组又显著低于Hp+PU组(P<0.05)(表1)。

Hp+PU组、Hp+PU+GP组CagA+患者比例均显著高于对照组(P<0.05)，但前两组间差异无统计学意义(P>0.05)。三组患者中，CagA+患者血清IL-9水平均显著低于CagA-患者(P<0.01)。Hp+PU+GP组CagA+患者血清IL-9水平显著低于Hp+PU组和对照组CagA+患者(P<0.05)(表2)。

组 别例数CagA(U/mL)IL-9(pg/mL)对照组4313.72±7.47102.91±51.33Hp+PU组6437.76±12.3189.73±24.65Hp+PU+GP组3141.50±6.9866.91±16.78

三、胃黏膜组织CagA、IL-9表达

Hp+PU组、Hp+PU+GP组胃黏膜CagA阳性面积比值显著高于对照组(P<0.01)，Hp+PU+GP组又显著高于Hp+PU组(P<0.05)。Hp+PU组、Hp+PU+GP组胃黏膜IL-9阳性面积比值显著低于对照组(P<0.05)，Hp+PU+GP组又显著低于Hp+PU组(P<0.01)(表3，图1)。

表2　三组CagA+患者比例及其血清IL-9水平

组 别例数CagA阳性面积比值IL-9阳性面积比值对照组431.31±0.4479.33±11.78Hp+PU组6447.73±13.4563.78±9.89Hp+PU+GP组3171.94±14.3334.32±12.99

A：对照组CagA表达；B：Hp+PU组CagA表达；C：Hp+PU+GP组CagA表达；D：对照组IL-9表达；E：Hp+PU组IL-9表达；F：Hp+PU+GP组IL-9表达

图1胃黏膜组织CagA、IL-9表达情况(免疫组化SP法，×200)

讨论

流行病学研究显示，全球约50%的人群感染Hp，其中10%以上可发展为PU和胃炎，1%~2%可发展为胃癌[5]。相关研究表明，Hp的致病性与致病岛、毒力因子、酶以及黏附因子等有关，其中CagA和空泡毒素A(VacA)为主要致病因子[6]。人群 感染的Hp菌株中，90%以上为CagA+菌株，CagA+Hp可引起更为严重的炎症反应和黏膜损伤，且导致PU和胃癌的可能性较大，这可能与CagA进入宿主胃黏膜细胞后，改变细胞形态、增强细胞迁移能力、降低细胞间黏附能力、促进上皮细胞向间质细胞转化、抑制抑癌基因p53表达等有关[6-7]。本研究发现，Hp感染伴PU和GP以及Hp感染仅伴PU患者的血清CagA水平、CagA+患者比例和胃黏膜CagA阳性面积比值均显著高于无Hp感染的慢性胃炎患者，且Hp感染伴PU和GP者胃黏膜CagA阳性面积比值显著高于Hp感染仅伴PU者，提示CagA与PU和GP的发生有关。需指出的是，尽管Hp感染伴PU和GP与CagA+之间有一定相关性，但CagA+并非前者的特异性标记物。目前亦有研究[8-9]发现CagA与动脉粥样硬化、脑梗死等有关。此外，血清学检测发现CagA受机体免疫功能以及IgG特性等诸多因素影响，在实验和临床检测中均可能出现假阳性结果[7]，因此本研究中Hp阴性但CagA+的患者可能为假阳性患者，需进一步行病理检查以及测定其他因子检测Hp感染。

IL-9是分子量为14 kDa(1 Da=0.992 1 u)的糖蛋白，在获得性免疫应答阶段由Th2细胞分泌，具有多效性免疫功能。先天免疫应答细胞如肥大细胞、嗜酸性细胞、中性粒细胞等亦能分泌IL-9[10]。程平[11]通过构建Hp/B0感染的BALB/c小鼠模型发现，Hp感染组IL-9 mRNA水平低于Hp未感染组；对模型小鼠行IL-9基因敲除后发现，其胃黏膜组织Hp定植量高于野生型小鼠；进一步通过检测临床血清标本发现，Hp阴性受检者IL-9水平明显高于Hp阳性受检者。上述结果提示IL-9表达减少与Hp感染相关，两者可能具有相互抑制作用。近年研究显示IL-9具有双重调节功能，一方面可负向调节细菌、病毒介导的炎症反应，并增加调节性T细胞(Treg细胞)的免疫抑制活性；另一方面可激活肥大细胞、巨噬细胞以及嗜酸性细胞，促进过敏反应和炎症[10]。本研究中，Hp感染伴PU和GP以及Hp感染仅伴PU患者的血清和胃黏膜IL-9表达水平均显著低于无Hp感染的慢性胃炎患者，提示Hp感染可能通过抑制IL-9表达，诱导PU和GP发生；CagA+Hp感染患者的血清IL-9水平显著低于CagA-Hp感染患者，提示CagA+可能在Hp抑制IL-9表达中发挥重要作用。而IL-9可能对Hp感染所致的PU和GP具有抑制作用。

综上所述，CagA+Hp感染可能与PU和GP的发生有关。IL-9参与了Hp感染诱导的免疫应答，且可能对Hp感染所致的PU和GP具有抑制作用，具体作用机制有待进一步研究证实。

参考文献

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3 张明海，戴前梅，胡春艳，等. IL-9与免疫性皮肤病的研究现状[J]. 中国皮肤性病学杂志, 2014, 28 (5): 524-526.

4 王如华，朱金水，邹静，等. 消化性溃疡患者CagA-Hp感染与血清IL-8、IL-10的相关性研究[J]. 中国临床医学, 2002, 9 (3): 254-257.

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7 Buti L, Spooner E, Van der Veen AG, et al.Helicobacterpyloricytotoxin-associated gene A (CagA) subverts the apoptosis-stimulating protein of p53 (ASPP2) tumor suppressor pathway of the host[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108 (22): 9238-9243.

8 陶珍，曲乐丰，丁素菊，等. 颈动脉粥样硬化斑块内幽门螺杆菌-细胞毒素相关蛋白A- IgG抗体的表达与颈动脉粥样硬化性脑梗死的关系[J]. 上海医学, 2009, 32 (4): 296-298.

9 杨旭，李瑛，赵晓丽，等. 细胞毒素相关蛋白A与缺血性脑卒中及亚型相关性研究[J].中风与神经疾病杂志, 2011, 28 (3): 247-250.

10Nowak EC, Noelle RJ. Interleukin-9 as a T helper type 17 cytokine[J]. Immunology, 2010, 131 (2): 169-173.

11程平. IL-9+CD4+T细胞/IL-9与幽门螺杆菌感染的相关性研究[D]. 重庆: 中国人民解放军第三军医大学, 2013.

(2014-08-15收稿；2014-10-31修回)

背景：研究表明幽门螺杆菌(Hp)感染与消化性溃疡(PU)和胃息肉(GP)的发生相关。细胞毒素相关蛋白A(CagA)是Hp致病的重要毒力因子，而白细胞介素-9(IL-9)是具有抗炎效应的细胞因子。目的：探讨CagA、IL-9在Hp感染伴PU和GP患者中的表达及其作用。方法：纳入2013年1月-2014年3月于惠东县人民医院就诊的Hp感染伴PU(Hp+PU组)或Hp感染伴PU和GP患者(Hp+PU+GP组)，无Hp感染的慢性胃炎患者作为对照组。采用 ELISA法检测血清CagA、IL-9水平；采用免疫组化法检测胃黏膜组织CagA、IL-9表达。结果：Hp+PU组、Hp+PU+GP组血清CagA水平均显著高于对照组(P<0.01)，血清IL-9水平均显著低于对照组(P<0.01)，且Hp+PU+GP组血清IL-9水平显著低于Hp+PU组(P<0.05)。Hp+PU组、Hp+PU+GP组CagA+患者比例均显著高于对照组(P<0.05)；三组患者中，CagA+患者血清IL-9水平均显著低于CagA-患者(P<0.01)，Hp+PU+GP组CagA+患者血清IL-9水平显著低于Hp+PU组和对照组CagA+患者(P<0.05)。Hp+PU组、Hp+PU+GP组胃黏膜CagA阳性面积比值显著高于对照组(P<0.01)，Hp+PU+GP组又显著高于Hp+PU组(P<0.05)。Hp+PU组、Hp+PU+GP组胃黏膜IL-9阳性面积比值显著低于对照组(P<0.05)，Hp+PU+GP组又显著低于Hp+PU组(P<0.01)。结论：CagA+Hp感染可能与PU和GP的发生有关。IL-9参与了Hp感染诱导的免疫应答，且可能对Hp感染所致的PU和GP具有抑制作用。

关键词幽门螺杆菌；消化性溃疡；胃息肉；细胞毒素类；白细胞介素9

Expressions and Effects of CagA and IL-9 inHelicobacterpyloriInfected Patients with Peptic Ulcer and Gastric PolypsCHENZhouli.SecondDepartmentofInternalMedicine,HuidongCountyPeople’sHospital,Huizhou,GuangdongProvince(516300)

Background: Studies showed thatHelicobacterpylori(Hp) infection was closely related with the pathogenesis of peptic ulcer (PU) and gastric polyps (GP). Cytotoxin-associated protein A (CagA) is an important virulence factor of Hp, and interleukin-9 (IL-9) is an anti-inflammatory cytokine. Aims: To investigate the expressions and effects of CagA and IL-9 in Hp infected patients with PU and GP. Methods: Hp infected patients with PU or PU+GP from January 2013 to March 2014 at Huidong County People’s Hospital were enrolled, and categorized into Hp+PU group and Hp+PU+GP group. Patients with chronic gastritis without Hp infection were served as control group. Serum levels of CagA and IL-9 were measured by ELISA method. Expressions of CagA and IL-9 in gastric mucosal tissue were determined by immunohistochemisty. Results: In Hp+PU group and Hp+PU+GP group, serum levels of CagA were significantly higher and serum levels of IL-9 were significantly lower than those in control group (P<0.01), and serum level of IL-9 in Hp+PU+GP group was significantly lower than that in Hp+PU group (P<0.05). Proportions of patients with CagA+in Hp+PU group and Hp+PU+GP group were significantly higher than that in control group (P<0.05). Serum levels of IL-9 in patients with CagA+were significantly lower than those in patients with CagA-in all three groups (P<0.01). Serum levels of IL-9 in patients with CagA+in Hp+PU+GP group were significantly lower than those in patients with CagA+in Hp+PU group and control group (P<0.05). Positive area ratio of CagA in gastric mucosal tissue in Hp+PU group and Hp+PU+GP group were significantly higher than that in control group (P<0.01), and that in Hp+PU+GP group was significantly higher than that in Hp+PU group (P<0.05). Positive area ratio of IL-9 in gastric mucosal tissue in Hp+PU group and Hp+PU+GP group were significantly lower than that in control group (P<0.05), and that in Hp+PU+GP group was significantly lower than that in Hp+PU group (P<0.01). Conclusions: CagA+Hp infection is associated with the pathogenesis of PU and GP. IL-9 is involved in the immune response induced by Hp infection and may exert an inhibitory effect on the pathogenesis of Hp-related PU and GP.

Key wordsHelicobacter pylori;Peptic Ulcer;Gastric Polyps;Cytotoxins;Interleukin-9

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.02.004