粪便抗原检测临床诊断幽门螺杆菌感染的可靠性研究

粪便抗原检测临床诊断幽门螺杆菌感染的可靠性研究

王佐妤*谢立群刘彩红赵红艳

武警后勤学院附属医院消化内科(300162)

*Email: zuoyuwang@126.com

幽门螺杆菌(Hp)是慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病菌，并与胃癌和胃黏膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤的发生密切相关。我国属于Hp感染高发国家，流行病学调查显示Hp现症感染率为42%~64%，平均55%[1]。1987年，Graham等[2]首次报道了13C-尿素呼气试验(13C-urea breath test,13C-UBT)这一非侵入性的Hp检测方法，其敏感性和特异性均在90%以上，现已成为临床诊断Hp感染的金标准。然而13C-UBT成本较高且检查前需禁食并停用抑酸药至少2周，使其临床应用受到一定限制。近年国内外研究发现使用经验证的单克隆抗体法检测Hp粪便抗原(Hp stool antigen, HpSA)对诊断Hp感染具有较高的敏感性和特异性，该方法亦为非侵入性，受试者不需口服任何试剂，操作简便、安全，价格低廉，适用于所有年龄和类型的患者，但国内因缺乏相应试剂而未能推广应用[3-5]。本试验收集340例受试者同时行13C-UBT和HpSA检测，以13C-UBT为金标准，评价待评估的HpSA检测试剂盒临床诊断Hp感染的可靠性。

对象与方法

一、研究对象

研究对象源自2012年11月至2013年6月武警后勤学院附属医院消化内科的就诊人群，根据知情同意原则，340例因常规临床诊疗或体检目的而行13C-UBT的受试者纳入研究，其中初诊329例，复诊11例；男144例，女196例，年龄11~91岁，平均51.86岁。入组者检查前4周内未服用过H2受体拮抗剂、质子泵抑制剂、铋剂和抗菌药物。

二、主要试剂和仪器

HpSA检测试剂盒(生物素-亲合素酶联免疫法，北京金豪制药股份有限公司)；尿素[13C]胶囊呼气试验药盒(含尿素[13C]75 mg，国药准字H20110130，深圳市中核海得威生物科技有限公司)；ZHP-2001型13C呼气质谱仪(北京中科科仪股份有限公司)。

三、方法

1. 粪便标本的收集和保存：少数受试者于就诊当天留取粪便标本，多数于第2天或择期留取后送至医院。粪便标本运送至实验室后，如拟于1~3 d内检测，标本置2~8 ℃冷藏保存；如拟于3 d后检测，标本置-20 ℃冷冻保存。对粪便标本进行编号，并记录受试者相关信息(就诊ID、性别、年龄、临床诊断、13C-UBT数据和结果等)。腹泻粪便或过度浸泡的粪便标本视为不合格标本，不可用于检测。

2. HpSA检测：黄豆大小的粪便标本以 400 μL稀释液稀释，离心后取50 μL上清液加入包被Hp单克隆抗体的微孔板，随后加入50 μL生物素标记的Hp单克隆抗体混匀，置于37 ℃温箱中60 min；清洗后加入100 μL亲和素/HRP，置于37 ℃温箱中30 min；清洗后加入100 μL显色剂，室温避光显色30 min后加入100 μL终止液，测定A450 nm-A620 nm(或A630 nm)。

质控：试剂盒中含阴性、弱阳性和中/强阳性质控品，每次检测时3个质控品须同时满足以下条件，方可确认检测结果有效：①阴性质控品A450 nm-A620 nm/630 nm<0.100；②弱阳性质控品A450 nm-A620 nm/630 nm≥0.105且<1.000；③中/强阳性质控品A450 nm-A620 nm/630 nm≥1.000。

结果判定：通过比较标本检测值与cut-off值判定检测结果。Cut-off=2.1×(阴性质控品A450 nm-A620 nm/630 nm)，如阴性质控品A450 nm-A620 nm/630 nm<0.05 则以0.05计，此时cut-off值为0.105。标本检测值≥cut-off值判定为Hp阳性。

3.13C-UBT：参照药盒说明书，受试者在清晨空腹状态下或禁食2 h后行13C-UBT。先采集一袋呼气样品，嘱受试者以少量饮水送服一粒尿素[13C]胶囊，禁饮食、禁吸烟静坐30 min后再采集一袋呼气样品。应用质谱法测定服药前(0 min)和服药后(30 min)呼气样品中的13C-CO2，结果以千分差值(δ‰)表示。δ‰=1000×(13C测定样品的放射性核素丰度/13C参比样品的放射性核素丰度-1)。

结果判定：检测值通常以δ‰30 min-δ‰0 min表示，≥4.0±0.4判定为Hp阳性。

四、统计学分析

应用医学统计软件PEMS3.1处理数据，以四格表法计算待评估的HpSA检测试剂盒与金标准13C-UBT的阳性符合率、阴性符合率和总符合率，以一致性检验(κ检验)分析两者的一致性，κ>0.75为一致性好，0.75≤κ≤0.4为一致性较好，κ<0.4为一致性差。

结果

待评估HpSA检测试剂盒与金标准13C-UBT结果的比对见表1，待评估试剂盒诊断Hp感染的阳性符合率为96.3%(184/191)，阴性符合率为75.8%(113/149)，总符合率为87.4%(297/340)，κ=0.737 522(95% CI: 0.632 905~0.842 140)，表明待评估试剂盒与金标准一致性较好，可靠性(可重复性)较高。

进一步在11例初诊13C-UBT阳性、行Hp根除治疗停药4周后疗效观察者中分析待评估试剂盒的可靠性，阳性符合率、阴性符合率和总符合率均为100%(表2)。

表1　待评估试剂盒与13C-UBT检测结果四格表

表211例疗效观察者中待评估试剂盒与13C-UBT检测结果四格表

待评估HpSA检测试剂盒金标准(13C-UBT)阳性阴性合计阳性3(a)0(b)3阴性0(c)8(d)8合计3811

讨论

目前临床上检测Hp感染的方法包括侵入性和非侵入性两类，其中侵入性方法系在胃镜直视下对可疑组织取活检，再对活检组织作进一步的检测，可诊断98%以上的Hp感染[6]，但因具有创伤性而不适用于儿童、妊娠期妇女以及不能耐受胃镜检查者；非侵入性方法包括血清Hp抗体检测、UBT、HpSA检测等。血清学试验是Hp成功培养以后首先开发的非侵入性检测方法，但由于Hp感染初期抗体可能尚未产生、Hp根除后抗体仍可持续存在数月甚至数年，该方法对于确定Hp现症感染和根除治疗后的疗效观察价值较低，适用于Hp感染的流行病学调查，而不适用于临床诊断[5,7]。Hp定植于胃黏膜上皮细胞表面，黏膜上皮每1~3 d更新一次，含Hp抗原的Hp代谢产物、死亡菌体崩解产物等随上皮细胞脱落，通过胃肠道随粪便排出。20世纪90年代，美国Meridian公司首次推出了基于多克隆抗体的HpSA检测技术，其后单克隆抗体逐渐取代了多克隆抗体，无论是对于未治疗者的筛查，还是根除治疗后的疗效确认，单克隆抗体的检测性能均可与UBT媲美[8]。采用HpSA检测Hp感染，受试者只需留取粪便标本而不需口服任何试剂，适用于所有年龄(包括儿童和老人)和所有类型(包括孕妇)的患者，且无任何毒性反应。此外，由于检测的是Hp抗原，因此可准确反映Hp现症感染情况。2012年，欧洲Hp研究组发布的Maastricht Ⅳ共识报告[9]和我国第四次全国Hp感染处理共识报告[5]均指出HpSA检测可用于Hp现症感染的诊断和根除治疗后的疗效观察，因此临床上可考虑以HpSA检测替代UBT。

本研究将13C-UBT作为金标准，评价待评估的HpSA检测试剂盒临床诊断Hp感染的可靠性，结果显示与金标准比对，待评估试剂盒的阳性符合率为96.3%，阴性符合率为75.8%，总符合率为 87.4%，κ系数为0.737 522，表明其用于临床诊断Hp感染具有较高的可靠性；对于根除治疗后疗效观察者，待评估试剂盒与金标准的总符合率达100%。分析少数病例HpSA检测结果与金标准不符的原因，可能有以下两点：①粪便标本质量不高可能是主要影响因素。本试验仅少数受试者于就诊当天行13C-UBT后留取粪便标本，多数是在第2天或择期留取，如受试者未能按医师交待的正确方法留取标本，可能导致粪便标本质量较差。此外，运输环节也可能对粪便标本的质量产生影响，如标本留取后未能及时送至医院等。②13C-UBT的检测误差可能是另一个影响因素。2012年欧洲Maastricht Ⅳ共识报告[9]报道的UBT敏感性为88%~95%，特异性为95%~100%，表明UBT在实际应用中确实存在检测误差问题。

综上所述，本试验结果表明待评估的酶联免疫法HpSA检测试剂盒用于临床诊断Hp感染，与金标准13C-UBT具有较高的符合率和一致性，结果可靠，可作为Hp现症感染诊断和根除治疗后的疗效观察指标在临床上推广应用。

参考文献

1 中国幽门螺杆菌科研协作组；张万岱，胡伏莲，萧树东，等. 中国自然人群幽门螺杆菌感染的流行病学调查[J]. 现代消化及介入诊疗, 2010, 15 (5): 265-270.

2 Graham DY, Klein PD, Evans DJ Jr, et al.Campylobacterpyloridetected noninvasively by the 13C-urea breath test[J]. Lancet, 1987, 1 (8543): 1174-1177.

3 杜娟，王鲁，王铮，等. 幽门螺杆菌抗原和抗体试验的诊断效能评估[J]. 中国卫生检验杂志, 2014, 24 (12):1673-1675, 1679.

4 Shimoyama T. Stool antigen tests for the management ofHelicobacterpyloriinfection[J]. World J Gastroenterol, 2013, 19 (45): 8188-8191.

5 中华医学会消化病学分会幽门螺杆菌学组/全国幽门螺杆菌研究协作组；刘文忠，谢勇，成虹，等. 第四次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告[J]. 胃肠病学, 2012, 17 (10): 618-625.

6 周殿元，王继德，张振书. 幽门螺杆菌研究的组织病理学技术. 见: 胡伏莲，周殿元主编. 幽门螺杆菌感染的基础与临床[M]. 第3版. 北京: 中国科学技术出版社, 2009: 523-535.

7 王继德，周殿元，成虹，等. 幽门螺杆菌研究的血清学技术. 见: 胡伏莲，周殿元主编. 幽门螺杆菌感染的基础与临床[M]. 第3版. 北京: 中国科学技术出版社, 2009: 536-547.

8 Selgrad M, Kandulski A, Malfertheiner P.Helicobacterpylori: diagnosis and treatment[J]. Curr Opin Gastroenterol, 2009, 25 (6): 549-556.

9 Malfertheiner P, Megraud F, O’Morain CA, et al; European Helicobacter Study Group. Management ofHelicobacterpyloriinfection -- the Maastricht Ⅳ/Florence Consensus Report[J]. Gut, 2012, 61 (5): 646-664.

(2014-10-16收稿；2014-11-23修回)

背景：我国属于幽门螺杆菌(Hp)感染高发国家。在众多Hp感染检测方法中，Hp粪便抗原(HpSA)检测具有非侵入性、敏感性和特异性较高、操作简便、价格低廉等优势。目的：评价HpSA检测试剂盒临床诊断Hp感染的可靠性。方法：340例行13C-尿素呼气试验(13C-UBT)的受试者同时留取粪便标本，以待评估的酶联免疫法HpSA检测试剂盒检测Hp感染。以13C-UBT为金标准，计算待评估试剂盒诊断Hp感染的阳性符合率、阴性符合率、总符合率和κ系数。结果：与13C-UBT结果比对，待评估HpSA检测试剂盒诊断Hp感染的阳性符合率为96.3%，阴性符合率为75.8%，总符合率为87.4%，κ系数为0.737 522。结论：待评估的HpSA检测试剂盒用于临床诊断Hp感染，与金标准13C-UBT具有较高的符合率和一致性，结果可靠，可在临床上推广应用。

关键词幽门螺杆菌；诊断；粪便抗原检测；13C-尿素呼气试验；结果可重复性

Reliability of Stool Antigen Test for Clinical Diagnosis ofHelicobacterpyloriInfectionWANGZuoyu,XIELiqun,LIUCaihong,ZHAOHongyan.DepartmentofGastroenterology,theAffiliatedHospitaloftheLogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce,Tianjin(300162)

Background:Helicobacterpylori(Hp) infection is prevalent in Chinese population. Various diagnostic methods have been developed for Hp infection, among which Hp stool antigen (HpSA) test attracts more attention for its non-invasiveness, high sensitivity and specificity, convenience and low-cost. Aims: To assess the reliability of a commercial HpSA test kit for clinical diagnosis of Hp infection. Methods: A total of 340 subjects receiving13C-urea breath test (13C-UBT) were asked to have their stool samples tested for HpSA by the commercial enzyme immunoassay kit. Using13C-UBT as gold standard, the positive, negative and overall agreement rates and the kappa statistic of the commercial HpSA test kit for diagnosis of Hp infection were calculated. Results: Compared with the result of13C-UBT, the positive, negative and overall agreement rates of the commercial HpSA test kit for diagnosis of Hp infection were 96.3%, 75.8% and 87.4%, respectively, with the kappa statistic being 0.737 522. Conclusions: A high agreement rate and consistency can be observed between the commercial HpSA test kit and the gold standard13C-UBT for clinical diagnosis of Hp infection. The kit is reliable for being used in clinical practice.

Key wordsHelicobacter pylori;Diagnosis;Stool Antigen Test;13C-Urea Breath Test;Reproducibility of Results

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.02.003