吡格列酮对急性脑缺血再灌注损伤大鼠TNF—α、IL—10和细胞凋亡的影响

赵俞+余智+卢波达+刘凯的+方来明

[摘要] 目的 探讨急性脑缺血再灌注损伤大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-10（IL-10）和细胞凋亡的变化规律及吡格列酮（Pioglitazone，PGZ）干预对上述指标的影响。 方法 将84只SD大鼠随机分为PGZ组（n=42）及对照组（n=42），前者通过改良Zea-longa法建立脑缺血再灌注损伤模型后立即经尾静脉注射10 mg/kg的PGZ，对照组则用同等剂量的生理盐水代替PGZ，以后各组分别每24小时腹腔注射1次等量PGZ/生理盐水，直至SD大鼠被处死，并以伤后处死时间分为7个亚组，分别为1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、3 d和7 d，每个亚组各6只。取缺血灶周围组织采用免疫组织化学方法检测并比较脑组织中TNF-α及IL-10的蛋白表达，同时采用TUNEL法观察并比较细胞凋亡情况。 结果 PGZ组TNF-α蛋白表达量较对照组明显下降（P<0.05），而IL-10显著上升（P<0.05），且两组中二者均呈显著负相关（P<0.01）；同时PGZ组脑组织细胞凋亡数量较对照组也有所下降（P<0.05）。结论 脑缺血再灌注损伤后，吡格列酮可能通过降低TNF-α的活性上调IL-10的表达，减轻炎症反应，阻止神经细胞进一步凋亡，从而对缺血再灌注损伤大鼠神经细胞发挥保护作用。

[关键词] 吡格列酮；脑缺血再灌注损伤；TNF-α；IL-10；细胞凋亡

[中图分类号] R743.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）35-0001-04

目前在2型糖尿病的治疗过程中，吡格列酮（Pioglitazone，PGZ）在减少外周组织和肝脏的胰岛素抵抗、增加依赖胰岛素的葡萄糖处理、减少肝糖的输出方面具有重要意义。研究表明，吡格列酮对脑缺氧缺血、低血糖、创伤和癫痫发作时发挥的神经保护作用与激活过氧化物酶增殖体激活受体-γ（PPARγ）抑制炎症等途径有关[1]。然而，其具体神经保护分子机制还有待进一步研究。故本实验采用PGZ对改良Zea-longa 法建立大脑中动脉缺血再灌注损伤模型大鼠进行治疗干预，检测TNF-α、IL-10蛋白的表达及其对细胞凋亡的影响，探讨其对脑缺血再灌注损伤大鼠神经保护分子机制，为该药用于脑缺血缺氧性疾病的临床防治提供实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验大鼠

选取84只清洁级雄性SD大鼠[浙江大学医学院动物实验中心提供，动物合格证号：SCXK（浙）2008-0033]，体重（265±15）g。实验前大鼠禁食不禁水12 h，用随机数字表法分为PGZ组42只、对照组42只，再根据伤后处死时间分为7个亚组，分别为1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、3 d和7 d，每个亚组各6只。

1.2 主要试剂

吡格列酮（PGZ）（美国Sigma公司）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及白细胞介素-10（IL-10）免疫组化试剂盒（美国R&D Systems公司）；TUNEL原位末端标记试剂盒（美国Promega公司）；电子显微镜（日本OLYMPUS公司）等。

1.3 大鼠脑缺血再灌注损伤模型的制备及处理

灌注。模型成功标志[2]：大鼠苏醒后出现术侧Horner综合征；爬行时跌倒或向右侧转圈；提尾悬拉后出现缺血灶对侧上肢蜷缩屈曲。PGZ组待大鼠自然苏醒后立即经尾静脉注射PGZ 10 mg/kg，对照组则经尾静脉注射等量的生理盐水，以后各组分别每24小时经尾静脉注射一次等量PGZ/生理盐水，直至大鼠被处死。

1.4 观察指标

1.4.1 TNF-α及IL-10蛋白的表达 大鼠深度麻醉成功后，开胸暴露并游离出心脏，以生理盐水灌洗到双肺色白，后再灌注冰冻（4℃）4%多聚甲醛，迅速断头取脑，多聚甲醛浸泡固定24 h。在距额叶前端2.5 mm和8.5 mm处行冠状切片，取中间5 mm厚的脑组织块，沿矢状缝左侧约1.5 mm处切除右侧部分，选取余下的左侧脑块作为检测标本，即缺血半暗带脑组织。自前往后连续冠状位切片，厚约6 μm，每隔10张取两张切片，严格按相关试剂盒提供的步骤进行检测，在400倍显微镜下随机取5个不重复视野，观察并计数阳性细胞数，求其平均值并采图。

1.4.2 TUNEL染色 严格按照TUNEL细胞凋亡试剂盒说明书进行操作。在400倍光镜下观察凋亡细胞（以胞核出现棕黄染色颗粒代表），并计算计数阳性细胞数，求其平均值并采图。

1.5 统计学方法

应用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析。计量资料用（x±s）表示，两组在不同时间点的指标比较分别采用两独立样本均数t检验与重复测量资料方差分析，组间因素为分组（PGZ组和对照组），组内因素为时间点（7个不同处死时间点），交互作用为分组×时间；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TNF-α蛋白的表达

PGZ组大鼠缺血灶周围组织中TNF-α在术后1 h中开始表达，3 h出现大量表达；6～24 h处于高度表达，再灌注损伤后3 d呈强表达，至7 d表达量有所降低，并显著低于对照组（P<0.05）；通过重复测量资料的方差分析结果显示，两组同一时间点TNF-α蛋白表达比较，差异具有统计学意义（F组间=16.207，P=0.000<0.01）；两组各不同时间点TNF-α蛋白表达差异具有显著性（F组内1=13.999，P=0.000<0.01；F组内2=12.337，P=0.000<0.01）；分组和时间之间不存在交互作用（F交互=1.759，P=0.188>0.05），即PGZ组和对照组TNF-α蛋白的表达在各时间点上的变化趋势是相同的，见表1、图1。

2.2 IL-10蛋白的表达

IL-10蛋白在损伤灶周围组织细胞核中1 h时高表达，但3～12 h阳性细胞数逐渐降低，24 h时阳性细胞数达到低峰，处于低表达状态，但7 d表达有所上升，并显著高于对照组（P<0.05）；通过重复测量资料的方差分析结果显示，两组同一时间点IL-10蛋白表达比较，差异具有统计学意义（F组间=9.819，P=0.002<0.01）；二组各不同时间点IL-10蛋白表达差异具有显著性（F组内1=105.707，P=0.000<0.01；F组内2=112.307，P=0.000<0.01）；分组和时间之间不存在交互作用（F交互=0.405，P=0.526>0.05），即PGZ组和对照组IL-10蛋白的表达在各时间点上的变化趋势是相同的，见表1及图2。

2.3 神经细胞凋亡变化

PGZ组大鼠损伤灶周围组织1 h开始出现凋亡细胞，3～24 h凋亡细胞数逐渐增多，3 d达到高峰，但7 d凋亡细胞数较前有所减少，并显著低于对照组（P<0.05）；采用重复测量资料的方差分析结果显示，两组同一时间点凋亡细胞数比较，差异具有统计学意义（F组间=6.585，P=0.012<0.01）；两组各不同时间点凋亡细胞数比较差异具有显著性（F组内1=19.979，P=0.000<0.01；F组内2=21.136，P=0.000<0.01）；分组和时间之间不存在交互作用（F交互=0.540，P=0.465>0.05），即PGZ组和对照组凋亡细胞数在各时间点上的变化趋势是相同的，见表1及图3。

2.4 TNF-α与IL-10蛋白的表达相关性分析

两组脑组织TNF-α与IL-10蛋白的表达均呈显著负相关，以TNF-α蛋白的表达为自变量（independent variable），用X表示。IL-10蛋白的表达为应变量（dependent variable），用Y表示。回归方程Y1=0.43-0.261X，r2=-0.937（P<0.01），Y1=4.16-0.738X，r2=-0.951（P<0.01）。

3 讨论

目前缺血性脑血管病已逐步成为导致人类死亡疾病中的首要因素[3]，造成劳动力丧失并花费巨额的医疗资源，对家庭和社会造成巨大的影响。因此，如何提高急性缺血性脑血管病的疗效是临床亟需解决的难题，而神经保护剂在缺血性脑血管疾病急性期的治疗中具有重要作用，故寻找有效的神经细胞保护剂是当代神经科学的重要课题之一。

脑缺血特别是缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）的病理生理过程极为复杂，其发病机制涉及脑组织炎症反应、能量代谢紊乱、兴奋性氨基酸（EAA）的细胞毒性等多个学说。这些环节并不是孤立存在的，而是密不可分，互为因果，彼此重叠，最终导致神经细胞的凋亡或坏死[4]。大量研究表明，脑缺血后炎症反应在缺血再灌注损伤发病机制中具有重要地位[5]。我们课题组前期的实验研究也已证实，缺血再灌注后核转录因子的表达和炎性细胞浸润参与了脑缺血再灌注损伤过程[6]。其中TNF-α由神经细胞、小胶质细胞和血管内皮细胞产生，是一种多效性促炎性细胞因子，其表达与细胞凋亡密切相关，随着TNF-α表达的减弱，所触发炎性反应及神经细胞凋亡损伤也逐渐缓解[7]。此外，IL-10作为一种多功能负性调节因子，可减少巨噬细胞产生金属蛋白酶、自由基等有毒物质；减轻兴奋性神经毒性诱导的神经细胞损害；下调炎性细胞因子，阻止炎症联级反应，对神经细胞具有一定程度的保护作用[8]。因此，在防治大鼠缺血再灌注脑损伤中细胞凋亡中，我们可以通过减少有害细胞因子的产生，增加有利细胞因子，从而达到减少缺血再灌注神经元凋亡所引起的继发性脑损伤[9]。保护受损细胞，是目前治疗缺血性脑血管疾病的一大靶点。

此外，细胞凋亡（Apoptosis）是细胞在体内外多种因素刺激诱导下，由多种基因严格调控而发生的有序变化的死亡过程。有文献报道[10，11]，PPARγ激动剂吡格列酮能促进PPARγ mRNA和蛋白的表达，活化细胞外信号调节激酶而抑制炎症因子的表达，增强其对脑缺血再灌注损伤后脑神经的保护效应，并且与剂量呈正比关系。本研究发现经PGZ处理后的各时间段大鼠脑组织TNF-α的表达较对照组显著降低，而IL-10的表达则相应增高，且两者的表达呈显著负相关，大鼠脑缺血半暗带中神经细胞凋亡数量明显减轻。由此我们推测，PGZ可通过下调TNF-α的释放能力，上调抗炎介质（IL-10）的表达，发挥免疫抗炎作用，从而减少细胞凋亡。

由此可见，吡格列酮可负性调节脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中TNF-α蛋白的表达，显著上调抗炎介质（IL-10）的释放，减轻了缺血后再灌注损伤，从而较大程度地减轻细胞凋亡，为该药在脑缺血再灌注损伤的治疗中提供了广阔的应用前景。

[参考文献]

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（收稿日期：2014-09-25）

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（收稿日期：2014-09-25）