Livin基因在结肠癌组织芯片中的表达及其与Bcl—2相关性研究

李海波+池圣亮

[摘要] 目的 探讨Livin基因在结肠癌组织芯片中的表达及其与Bcl-2相关性。 方法 选取结肠癌外科手术患者60例，采用免疫组化MaxVisionTM二步法检测结肠癌组织芯片中Livin、Bcl-2基因的表达。另取切缘正常结肠组织芯片25例作对照。 结果 结肠癌组织芯片中Livin基因阳性表达率（63.33%）显著高于切缘正常的结肠组织芯片（24.00%）（χ2=10.93，P<0.01）。结肠癌组织芯片中Livin基因表达与性别、年龄、肿瘤大小、组织分化程度和淋巴结转移等病理特征无相关性（P>0.05），与浸润深度、Dukes分期和远处转移等密切相关（P<0.05或P<0.01）。结肠癌组织芯片中Bcl-2基因阳性表达率（68.33%）显著高于切缘正常结肠组织（4.00%）（χ2=29.22，P<0.01）。结肠癌组织芯片中Livin基因表达与Bcl-2基因存在明显的正相关（P<0.01）。多因素Logistic回归分析提示，浸润深度、Dukes分期和远处转移进入模型（P<0.05）。 结论 Livin基因在结肠癌组织芯片的发病中扮演重要角色，与其恶性侵袭、转移病理过程密切相关。Livin基因与Bcl-2基因的异常表达可能在结肠癌癌变中起协调作用。

[关键词] 结肠癌；免疫组化；Livin基因；病理特征

[中图分类号] R735.3+5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）35-0021-04

结肠癌是临床较常见的消化道恶性肿瘤之一，近年来其发病率有逐年上升的趋势。肿瘤的发生与肿瘤细胞的增生及凋亡受抑制密切相关，尤其是细胞凋亡的调节障碍或表达异常在肿瘤的发生和发展起及其重要的作用。Livin基因是凋亡抑制蛋白（IAPs）家族的新成员，在正常成人组织中无明显的表达或表达较低，近年来研究发现其在大部分肿瘤组织中表达异常[1，2]。Bcl-2是临床较常用的一种凋亡相关基因， 与肿瘤的发生和发展关系密切[3]。Livin基因在结肠癌组织中的表达及其与Bcl-2的相关性研究目前国内外报道较少[3，4]。本研究旨在观察Livin基因在结肠癌组织芯片中的表达及其与Bcl-2的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010年1月～2014年7月我院普外科就诊结肠癌外科手术患者60例。纳入患者：术前具有完整临床资料，且均未进行任何辅助化放疗和免疫治疗。患者中男39例，女21例；年龄38 ～89岁，平均（63.1±7.1）岁。另取切缘正常结肠组织25例作对照研究，其中男16例，女9例；年龄39～86岁，平均（62.9±6.4）岁。结肠癌组与正常结肠组织在性别构成和年龄分布方面比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 组织芯片的制备

用组织陈列仪在模板蜡块上打出直径为2 mm的小孔，选取HE染色下所见典型癌组织区域2 mm柱状组织，按顺序填在模板蜡块中，将蜡块表面压平整，二次包埋后制成组织芯片，4～6 μm连续切片，进行免疫组化染色。

1.3 免疫组化染色

采用免疫组化MaxVisionTM二步法进行检测，具体步骤参照文献[5]。采用已知阳性片和磷酸盐缓冲液（PBS）分别行阳性对照或阴性对照，其中鼠抗人Livin单克隆抗体及免疫组化MaxVisionTM二步法试剂盒均购买自北京中杉金桥公司，鼠抗人Bcl-2单克隆抗体购自福州迈新生物有限公司。

1.4 免疫组化结果判定[6]

Livin阳性细胞定位于胞浆，Bcl-2阳性细胞定位于胞膜或细胞浆，以出现棕黄色颗粒为阳性。按照染色百分比和强度判断其结果。其中染色百分比<5%为0分、6%～25%为1分、26%～50%为2分、51%～75%为3分；76%～100%为4分；染色强度得分无着色为0分；浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。如染色细胞百分比和染色强度得分乘积>1判断为阳性（+），≤1判断为阴性（-）。

1.5 统计学处理

应用SPSS16.0软件，计数资料采用χ2检验，相关性分析采用Speaman分析，Livin基因与各因素间的关系采用多因素Logistic回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织芯片免疫组化染色

制作组织芯片各位点排列整齐，厚薄一致，位点结构保持良好，无位点脱落。Livin免疫组化阳性产物呈胞浆棕黄色细颗粒状，Bcl-2免疫组化阳性产物呈胞浆或胞膜棕黄色细颗粒状。

2.2 结肠癌及切缘正常结肠组织芯片中Livin基因表达

60例结肠癌组织芯片中Livin基因阳性表达38例（63.33%）；而25例切缘癌旁正常结肠中Livin基因阳性表达仅6例（24.00%）。结肠癌组织中Livin基因阳性表达率显著高于切缘正常结肠组织（χ2=10.93，P<0.01）。

2.3 结肠癌组织芯片中Livin基因表达与病理特征的相关性

结肠癌组织芯片中Livin基因表达与性别、年龄、肿瘤大小、组织分化程度和淋巴结转移等无明显相关性（P>0.05），与浸润深度、Dukes分期和远处转移等密切相关（P<0.05或P<0.01）。见表1。

2.4 结肠癌及切缘正常结肠组织芯片中的Bcl-2基因表达

60例结肠癌组织芯片中Bcl-2基因阳性表达41例（68.33%）；而25例切缘癌旁正常结肠组织芯片中Bcl-2基因阳性表达仅1例（4.00%）。结肠癌组织芯片中Bcl-2基因阳性表达率显著高于切缘正常结肠组织（χ2=29.22，P<0.01）。

2.5 结肠癌组织芯片中Livin基因表达与Bcl-2基因的相关性分析endprint

38例结肠癌组织芯片中Livin基因阳性表达有 37例Bcl-2基因阳性表达；22例结肠癌组织芯片中Livin基因阴性表达有4例Bcl-2基因阳性表达，统计学分析示结肠癌组织芯片中Livin基因表达与Bcl-2基因存在明显正相关（r=0.74，P<0.01）。

2.6 Logistic回归分析Livin基因与各因素间的关系

以Livin基因免疫组化结果为应变量，以患者的性别、年龄、肿瘤大小、组织分化程度、浸润深度、Dukes分期、淋巴结转移和远处转移标准为自变量进行Logistic回归分析。结果发现浸润深度、Dukes分期和远处转移进入模型（P<0.05）。见表2、3。

3 讨论

Livin基因是IAPs家族中新的凋亡抑制基因，定位于20号染色体q13.3，分别编码298个和280个氨基酸的Livin-α及Livin-β[7，8]。Livin基因的抗细胞凋亡机制主要通过抑制Caspase-3、7和9途径和阻断以线粒体为基础的外源性及内源性凋亡途径来起到抗细胞凋亡的效应，与肿瘤的发生、发展、转移及预后的关系较密切[2，9]。近年来Livin基因在胃肠道肿瘤中的表达，尤其是结肠癌组织中的表达已逐渐受到临床的重视[10，11]。郑国文[12]研究发现凋亡抑制因子Livin基因在大肠癌中起极其重要的作用，参与大肠癌的发生、发展及转移过程。东星等[13]研究也发现Livin基因在大肠癌的发生、发展中起重要作用，可望成为大肠癌生物及免疫干预的标志。本研究结果发现，结肠癌组织芯片中Livin基因阳性表达率显著高于切缘正常的结肠组织，可见Livin基因在结肠癌组织芯片中异常高表达，在结肠癌的发病过程中扮演重要角色。

但有关结肠癌组织Livin基因的表达与肿瘤直径、组织分化程度、浸润深度、Dukes分期、淋巴结转移和远处转移等病理特征的关系国内外报道不一致，尚未形成统一的结论[14，15]。何剪太等[16]研究发现，大肠癌组织中Livin基因的表达与患者的年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤部位、组织学类型、淋巴转移和Dukes等生物学行为均无明显关系，而与患者远处转移及放化疗存在明显相关性，提示Livin基因可影响大肠癌的生物行为，使其更易发生远处转移。菅金波等[5]研究发现，凋亡抑制因子Livin与结肠癌患者的肿瘤浸润深度、Dukes分期、临床分期以及远处转移存在明显相关性，提示其与肿瘤的恶性侵袭、转移和预后过程明显相关。本研究结果发现，结肠癌组织芯片中Livin基因表达与性别、年龄、肿瘤大小、组织分化程度和淋巴结转移等病理特征无明显相关性，与肿瘤的浸润深度、Dukes分期和远处转移等病理特征密切相关，同时Logistic回归分析发现，浸润深度、Dukes分期和远处转移进入模型。提示Livin基因在结肠癌组织中的表达与其病情的进展关系密切，是Livin基因表达的危险因素，尤其是与肿瘤的恶性侵袭、转移的病理过程密切相关。可见Livin基因在结肠癌的发病过程中扮演重要角色，参与病情的发生、发展过程。

肿瘤的发生是一个多因素、多步骤、多基因共同作用的结果。Bcl-2是一个原癌基因，其功能是阻遏细胞凋亡，其过度表达已被证实存在于多种肿瘤组织中[4]。本研究结果发现，结肠癌组织芯片中Bcl-2基因阳性表达率显著高于切缘正常结肠组织，可见Bcl-2基因在结肠癌组织中异常高表达，在结肠癌的发病过程中扮演重要角色；同时研究还发现结肠癌中Livin基因表达与Bcl-2的表达呈正相关，Livin基因与Bcl-2基因通过作用于细胞凋亡的不同阶段而协同发挥抗凋亡效应，从而在促进结肠癌发生、发展中起协同作用[17，18]。Livin基因有望作为大肠癌的基因诊断及治疗的新作用靶点，从而开辟生物治疗结肠癌的新途径。但Livin基因能否作为结肠癌新的肿瘤标志物并应用于临床、Livin与放化疗耐药性的关系有待进一步的深入研究。

总之，Livin基因在结肠癌组织芯片中异常高表达，并与肿瘤的浸润深度、Dukes分期和远处转移等密切相关，说明Livin基因在结肠癌的发病过程中扮演重要角色，与肿瘤的恶性侵袭、转移的病理过程密切相关。Livin基因与Bcl-2基因的异常表达可能在结肠癌癌变中起协调作用。

[参考文献]

[1] 黄方名，王文忠. 新凋亡抑制因子 Livin 与肿瘤的研究进展[J]. 中华全科医学，2011，9（12）：1934-1936.

[2] Maas C，Verbrugge I，de Vries E，et al. Smac/DIABLO release from mitochondria and XIAP inhibition are essential to limit clonogenicity of type I tumor cells after TRAIL receptor stimulation[J]. Cell Death Differ，2010，17（10）：1613-1623.

[3] Nedelcu T，Kubista B，Koller A，et al. Livin and Bcl-2 expression in high-grade osteosarcoma[J]. Cancer Res Clin Oncol，2008，134（2）： 237-244.

[4] Wang X，Xu J，Ju S，et al. Livin gene plays a role in drug resistance of colon cancer cells[J]. Clin Biochem，2010，43（7-8）：655-666.

[5] 菅金波，葛莲英，罗小玲，等. Livin蛋白在人大肠癌组织中的表达及临床意义[J]. 中国癌症防治杂志，2011，3（1）：43-46.endprint

[6] 熊雅波，韩子华. 结肠癌组织中Livin的表达及其与患者生物学行为与预后的关系[J]. 中国药物与临床，2012， 12（8）：1017-1018.

[7] Wang TS，Ding QQ，Guo RH，et al. Expression of livin in gastric cancer and induction of apoptosis in SGC-7901 cells by shRNA-mediated silencing of livin gene[J]. Biomed Pharmacother，2010，64（5）：333-338.

[8] 陆娜娜，尹玉，曹立宇，等. 大肠癌中Livin和Survivin的表达及相关性研究[J]. 中国组织化学与细胞化学杂志，2012，21（3）：250-251.

[9] 姚文娟，陈素萍，宋会双，等. Livin基因在结直肠癌中的表达及其与 PTEN 和Caspase-3的相关性研究[J]. 大连医科大学学报，2014，36（3）：221-224.

[10] Xi RC，Biao WS，Gang ZZ. Significant elevation of survivin and livin expression in human colorectal cancer： inverse correlation between expression and overall survival[J]. Onkologie，2011，34（5）：428-432.

[11] Yang D，Song X，Zhang J，et al. Suppression of livin gene expression by siRNA leads to growth inhibition and apoptosis induction in human bladder cancer T24 cells[J].Biosci Biotechnol Biochem，2010，74（5）：1039-1044.

[12] 郑国文. 大肠癌中 Livin 和 Survivin 的表达及相关性研究[J]. 实用医院临床杂志，2014，11（2）：86-87.

[13] 东星，于波，周卫东. Livin与Caspase-9在大肠癌组织中的表达及临床意义[J]. 中国现代普通外科进展，2010， 13（12）： 933-936.

[14] 严红，彭淑梅，邱春雷. 大肠癌组织中Livin表达的临床意义[J]. 江西医药，2010，46（2）： 109-111.

[15] 陈鹏，王春松，孔令斌. 凋亡抑制蛋白Livin 与胃癌的研究进展[J]. 实用医学杂志，2008，24（23）：3991-3992.

[16] 何剪太，李珍发，张阳德，等. 凋亡抑制因子Livin在大肠癌中的表达意义[J]. 中国现代医学杂志，2007，17（6）：654-657.

[17] 黄青远，赵志龙，崔肃，等. Livin在食管癌中的表达及与Bcl-2相关性研究[J]. 现代肿瘤医学，2007，15（3）：326-328.

[18] 洪思蔚，赵亚刚. 凋亡抑制蛋白Livin与消化系统肿瘤的相关研究进展[J]. 医学综述，2013，19（4）：59-61.

（收稿日期：2014-09-11）endprint

[6] 熊雅波，韩子华. 结肠癌组织中Livin的表达及其与患者生物学行为与预后的关系[J]. 中国药物与临床，2012， 12（8）：1017-1018.

[7] Wang TS，Ding QQ，Guo RH，et al. Expression of livin in gastric cancer and induction of apoptosis in SGC-7901 cells by shRNA-mediated silencing of livin gene[J]. Biomed Pharmacother，2010，64（5）：333-338.

[8] 陆娜娜，尹玉，曹立宇，等. 大肠癌中Livin和Survivin的表达及相关性研究[J]. 中国组织化学与细胞化学杂志，2012，21（3）：250-251.

[9] 姚文娟，陈素萍，宋会双，等. Livin基因在结直肠癌中的表达及其与 PTEN 和Caspase-3的相关性研究[J]. 大连医科大学学报，2014，36（3）：221-224.

[10] Xi RC，Biao WS，Gang ZZ. Significant elevation of survivin and livin expression in human colorectal cancer： inverse correlation between expression and overall survival[J]. Onkologie，2011，34（5）：428-432.

[11] Yang D，Song X，Zhang J，et al. Suppression of livin gene expression by siRNA leads to growth inhibition and apoptosis induction in human bladder cancer T24 cells[J].Biosci Biotechnol Biochem，2010，74（5）：1039-1044.

[12] 郑国文. 大肠癌中 Livin 和 Survivin 的表达及相关性研究[J]. 实用医院临床杂志，2014，11（2）：86-87.

[13] 东星，于波，周卫东. Livin与Caspase-9在大肠癌组织中的表达及临床意义[J]. 中国现代普通外科进展，2010， 13（12）： 933-936.

[14] 严红，彭淑梅，邱春雷. 大肠癌组织中Livin表达的临床意义[J]. 江西医药，2010，46（2）： 109-111.

[15] 陈鹏，王春松，孔令斌. 凋亡抑制蛋白Livin 与胃癌的研究进展[J]. 实用医学杂志，2008，24（23）：3991-3992.

[16] 何剪太，李珍发，张阳德，等. 凋亡抑制因子Livin在大肠癌中的表达意义[J]. 中国现代医学杂志，2007，17（6）：654-657.

[17] 黄青远，赵志龙，崔肃，等. Livin在食管癌中的表达及与Bcl-2相关性研究[J]. 现代肿瘤医学，2007，15（3）：326-328.

[18] 洪思蔚，赵亚刚. 凋亡抑制蛋白Livin与消化系统肿瘤的相关研究进展[J]. 医学综述，2013，19（4）：59-61.

（收稿日期：2014-09-11）endprint

[6] 熊雅波，韩子华. 结肠癌组织中Livin的表达及其与患者生物学行为与预后的关系[J]. 中国药物与临床，2012， 12（8）：1017-1018.

[7] Wang TS，Ding QQ，Guo RH，et al. Expression of livin in gastric cancer and induction of apoptosis in SGC-7901 cells by shRNA-mediated silencing of livin gene[J]. Biomed Pharmacother，2010，64（5）：333-338.

[8] 陆娜娜，尹玉，曹立宇，等. 大肠癌中Livin和Survivin的表达及相关性研究[J]. 中国组织化学与细胞化学杂志，2012，21（3）：250-251.

[9] 姚文娟，陈素萍，宋会双，等. Livin基因在结直肠癌中的表达及其与 PTEN 和Caspase-3的相关性研究[J]. 大连医科大学学报，2014，36（3）：221-224.

[10] Xi RC，Biao WS，Gang ZZ. Significant elevation of survivin and livin expression in human colorectal cancer： inverse correlation between expression and overall survival[J]. Onkologie，2011，34（5）：428-432.

[11] Yang D，Song X，Zhang J，et al. Suppression of livin gene expression by siRNA leads to growth inhibition and apoptosis induction in human bladder cancer T24 cells[J].Biosci Biotechnol Biochem，2010，74（5）：1039-1044.

[12] 郑国文. 大肠癌中 Livin 和 Survivin 的表达及相关性研究[J]. 实用医院临床杂志，2014，11（2）：86-87.

[13] 东星，于波，周卫东. Livin与Caspase-9在大肠癌组织中的表达及临床意义[J]. 中国现代普通外科进展，2010， 13（12）： 933-936.

[14] 严红，彭淑梅，邱春雷. 大肠癌组织中Livin表达的临床意义[J]. 江西医药，2010，46（2）： 109-111.

[15] 陈鹏，王春松，孔令斌. 凋亡抑制蛋白Livin 与胃癌的研究进展[J]. 实用医学杂志，2008，24（23）：3991-3992.

[16] 何剪太，李珍发，张阳德，等. 凋亡抑制因子Livin在大肠癌中的表达意义[J]. 中国现代医学杂志，2007，17（6）：654-657.

[17] 黄青远，赵志龙，崔肃，等. Livin在食管癌中的表达及与Bcl-2相关性研究[J]. 现代肿瘤医学，2007，15（3）：326-328.

[18] 洪思蔚，赵亚刚. 凋亡抑制蛋白Livin与消化系统肿瘤的相关研究进展[J]. 医学综述，2013，19（4）：59-61.

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