多西环素对树突状细胞功能的影响

赵鹏,孙伟红,魏晓芳,卜晓翠,高岱清

（青岛市中心医院，山东 青岛 266042；#青岛大学医学院附属心血管病医院）

多西环素(doxycycline)是一种常用的半合成四环素类抗生素，通过抑制细菌的蛋白合成发挥杀菌作用。也有报道多西环素除抗菌作用外，在治疗实验性变应性脑脊髓炎、帕金森病、多发性硬化症、恙虫病和脊髓损伤过程中也具有一定疗效[1-5]。研究发现多西环素的治疗作用与抗炎作用有关，后者可抑制小神经胶质细胞的活化和增值，减少小神经胶质细胞分泌细胞因子[6,7]。但是目前关于多西环素具体的抗炎机制尤其对于适应性免疫的调节作用还不清楚。

树突状细胞（Dendritic cell，DC）是一种体内重要的抗原递呈细胞，其既可启动适应性的免疫应答反应，也可诱导中枢和外周耐受。而多西环素对DC 分化成熟和功能方面的研究已有报道。因此，我们在DC 培养条件下加入多西环素，观察多西环素对DC表型和功能的影响，以揭示多西环素的抗炎机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 重组人IL-4 和GM-CSF 购自R&D 公司，1640 培养基和胎牛血清购自PAA 公司，LPS 购自Sigma 公司，抗CD83、CD80 和HLA-DR 荧光抗体购自BD 公司，抗CD3 标记磁珠购自Miltenyi Biotec 公司，MACS 分离柱购自Miltenyi Biotec。

1.1.2 仪器CO2 培养箱（上海力康），RT-6000 酶标仪（雷杜公司），倒置显微镜（日本olympus），FACSCalibur 流式细胞仪（美国BD 公司）。

1.2 方法

1.2.1 人外周血单核细胞来源的DC 的诱导Ficoll不连续密度梯度离心法分离健康人外周血单个核细胞，贴壁培养细胞加入rhIL-4(500 U/mL)及rhGMCSF(500 U/mL)诱导向DC 分化，在37℃，5%CO2 条件下培养5 天后，用LPS(1μg/mL)诱导成熟。对照组只加IL-4 和GM-CSF 培养5 天，1μg/mLLPS 培养2天后诱导成熟。处理组IL-4 和GM-CSF 培养5 天后，分别加入100 ng/mL 和300 ng/mL 的多西环素同LPS一起培养两天。

1.2.2 流式检测 分别取各组细胞，用PBS 洗两次，调整细胞密度1 ×106 个/mL，100μL 重悬细胞，按照试剂盒说明分别用FITC 标记的CD83、CD80 和HLADR 标记各组细胞，震荡均匀，室温避光放置20 min，1 200 rpm 离心5 min，弃上清，加入2mL PBS，1 200 rpm 离心5 min，弃上清，加入400μLPBS，混匀后上机检测。

1.2.3 ELISA 加0.1 mL 离心后的细胞培养上清液于反应孔中，置37℃孵育60 min。然后洗板5 次。同时设有空白孔和标准品孔。在各反应孔中，加入新鲜稀释的生物素化抗体工作液0.1 mL，37℃孵育1小时，洗板5 次。加酶结合工作液0.1 mL，37℃避光孵育30 min，洗板5 次。加入0.1 mL 显色底物液，37℃避光孵育15 min 后，于各反应孔中加入终止液0.1 mL，混匀后10 min 内测量OD 值。

1.2.4 T 细胞增值实验 用抗CD3 标记磁珠(Miltenyi Biotec)和MACS 分离柱(Miltenyi Biotec)，通过免疫磁珠阳性选择从单个核细胞中分离T 细胞，各组DCs与CD3+T 细胞以1:20 比例共培养96 h。在终止培养前16 h 每孔加入10μL3H-TdR，通过闪烁记数仪中测定每个样品的每分钟脉冲数，并计算其增值数值。

1.3 统计学处理 应用SPSS11.0 统计软件进行统计分析。数据采用±s表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 多西环素对树突状细胞形态和表型的影响 如图1,细胞形态呈现动态变化,培养至第7 天后,可见对照组和处理组具有典型DC 细胞的特征,细胞体积明显增大,表面可见细小的毛刺状突起，各组细胞形态无明显差异。台盼蓝染色发现对照组和实验组大剂量多西环素诱导细胞发生死亡没有显著差异。收集培养7 d 的各组细胞，通过流式检测100 ng/mL 和300 ng/mL 多西环素处理组DC 表面HLA-DR 表达相对于对照组明显下调，而各组DC 表面表达CD83 和CD80 无显著差异。

图1 多西环素对DC 表型的影响

2.2 多西环素对DC 细胞因子分泌的影响 收集各组DC 的培养上清ELISA 检测(图2),发现100 ng/mL和300ng/mL 多西环素处理组IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-12 分泌较对照组明显下调，且随着剂量增加细胞因子分泌减少，而对IL-10 分泌无影响。

图2 多西环素抑制DC 分泌IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-12

2.3 DC 对异基因淋巴细胞的增殖的作用 收集培养第7 天的各组DC 作为刺激细胞,与同种型外周血T 细胞混合培养。如图3,结果显示100 ng/mL 和300 ng/mL 多西环素处理组诱导同型T 细胞增殖的能力显著低于对照组，且随着多西环素剂量增加刺激T 细胞增殖的能力变弱。

图3 多西环素抑制DC 诱导的异基因淋巴细胞的增殖

3 讨论

多西环素是一种抗生素，其也是一种抗炎药物。多西环素的抗炎作用源于其抑制金属蛋白酶的表达[4]，近来研究发现多西环素可抑制巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6 和IL-8 等炎症介质[7]。也有研究发现，多西环素能诱导多种免疫细胞发生凋亡。而目前关于多西环素对DC 分化成熟和功能影响的研究很少。

实验性变应性脑脊髓炎、多发性硬化症、恙虫病感染和脊髓损伤与T 细胞介导免疫反应有关[9,10]。而树突状细胞作为一种抗原递呈细胞，在启动特异性T细胞免疫应答中发挥关键作用[11,12]。DC 为T 细胞活化提供三个信号，除为T 细胞提供抗原肽:MHC 分子复合物这一抗原信号外，还表达高水平辅助刺激分子HLA-DR、CD80 和CD86，为T 细胞提供充足第二信号。此外，DC 也分泌IL-12、IL-6、IL-1β和TNFα促进免疫应答反应，而分泌IL-10 抑制免疫反应。本研究我们发现100 ng/mL 和300 ng/mL 多西环素处理组DC 较对照组HLA-DR 的表达明显下调，而CD83 和CD80 的表达无显著差异。两多西环素处理组DC 较对照组分泌IL-6、TNF-α和IL-12 显著减少，刺激T 细胞增殖的能力降低，且具有剂量依赖性。这些结果表明多西环素可通过影响DC 的分化成熟、细胞因子分泌和刺激T 细胞增值能力而发挥抗炎作用。

本研究证实了多西环素可通过影响DC 的抗原递呈能力、细胞因子的分泌、刺激T 细胞增殖能力而发挥抗炎作用，为临床应用提供理论依据。

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