槲皮素对N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)诱导损伤的视网膜神经节细胞的保护作用及其机制

程钰 王亮 田莹 赵俊宏 曹燕 郭建强

视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell，RGC)的凋亡和(或)死亡是青光眼不可逆性失明的主要病因[1]。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)可与细胞表面的受体特异性结合，诱发细胞谷氨酸兴奋性毒性和氧化应激反应[2]。槲皮素(Quercetin)是一种天然的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抑制新生血管生成等作用[3]。研究表明，槲皮素能减轻过氧化氢诱导的视网膜色素上皮细胞损伤，并通过抗内质网应激、抗凋亡的机制发挥心血管保护作用[4-6]。本研究通过建立NMDA诱导小鼠RGC-5细胞氧化应激损伤模型，分析槲皮素对损伤后RGC的保护作用和机制，从而为青光眼的临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料小鼠RGC-5细胞株、DMEM培养液(美国Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；兔抗小鼠Bcl-2、Bax、p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)、磷酸化的p38 MAPK(phosphorylated p38 MAPK，p-p38 MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、磷酸化的JNK(phosphorylated JNK，p-JNK)、β-actin抗体(美国Abcam 公司)；槲皮素(中国药品生物制品检定所)；茴香霉素(Anisomycin，ANISO)和 P79350(美国Calbiochem公司)；辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗 (武汉博士德生物公司)；NMDA、噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)试剂盒和Caspase-3检测试剂盒(美国Sigma公司)；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、一氧化氮 (nitric oxide，NO)检测试剂盒(南京建成生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及药物处理采用快速融化法复苏细胞，用低糖(1 g·L-1)、含体积分数10%胎牛血清、100 g·L-1双抗的DMEM培养液，在37 ℃、体积分数5%CO2的细胞培养箱中培养，每2～3 d用5 g·L-1胰蛋白酶消化传代1次。取对数生长期的细胞进行实验。所有实验中，在NMDA(100 μmol·L-1)处理前，将细胞转移至无血清培养基中饥饿24 h。

1.2.2 实验分组将细胞分为对照组(不加任何干预因素)、NMDA组(在细胞培养体系中加入终浓度为100 μmol·L-1的NMDA作用24 h)、NMDA+槲皮素处理组(加入终浓度分别为1 μmol·L-1、10 μmol·L-1、100 μmol·L-1的槲皮素预处理2 h后再加入终浓度为100 μmol·L-1的NMDA作用24 h)、槲皮素处理组(只加入10 μmol·L-1的槲皮素处理2 h)、NMDA+槲皮素+ ANISO / P79350处理组(加入终浓度为10 μmol·L-1的槲皮素预处理2 h后再加入终浓度为100 μmol·L-1的NMDA作用24 h，实验结束前1 h加入25 μg·L-1的ANISO或50 μmol·L-1的P79350)。

1.2.3 MTT法检测细胞存活情况各组细胞经相应处理后加入MTT溶液(5 g·L-1)10 μL，孵育4 h，弃上清，按每孔100 μL加入DMSO，振荡10 min，酶标仪490 nm处读取吸光度(A值)。每个实验组设置6个复孔。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率收获细胞，用胰蛋白酶消化，制成悬浮细胞液，立即加入10 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL PI，振荡混匀，避光，室温孵育15 min后与300 μL的结合缓冲液混合加入流式细胞仪进行细胞凋亡检测。

1.2.5 ELISA检测LDH、SOD、ROS、MDA、NO水平将细胞接种于24孔板(每孔50×103个)，相应药物处理后，收集上清液，ELISA法检测LDH、SOD、ROS、MDA、NO的浓度。具体操作依据试剂盒说明书进行。

1.2.6 Western blot检测利用核蛋白/总蛋白裂解液裂解细胞、提取蛋白，SDS-PAGE电泳分离蛋白。电泳结束后将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，50 g·L-1脱脂奶粉封闭后，按照常规的方法加入兔抗小鼠Bcl-2、Bax、p38、p-p38、JNK、p-JNK、β-actin的抗体孵育，并加入HRP标记的山羊抗兔二抗，Western blot检测Bcl-2、Bax、p38、p-p38、JNK、p-JNK的蛋白表达，Scion Image图像分析系统对所得条带进行分析，蛋白质的相对含量以目的蛋白与β-actin条带吸光度(A值)的比值表示。

1.2.7 RT-PCR检测Bax、Bcl-2、nNOS和iNOS基因表达采用Trizol试剂提取各组细胞总RNA，按逆转录反应按试剂盒说明进行，PCR扩增引物采用引物在线软件设计并检测分析，最后由上海生物工程有限公司合成，Bax上游引物：5’-CTGGATCCAAGACCAGGGTG-3’，下游引物：5’-CTTCCAGATGGTGAGCGAGG-3’；Bcl-2上游引物：5’-CGTCGTGACTTCGCAGAGAT-3’，下游引物：5’-CAATCCTCCCCCAGTTCACC-3’；nNOS上游引物：5’-ATCCTCCCTCTGGAAGGACC-3’，下游引物：5’-TTGATGAAGGACTCGGTGGC-3’；iNOS上游引物：5’-GAGCAACTACTGCTGGTGGT-3’，下游引物：5’-CGATGTCATGAGCAAAGGCG-3’；β-actin上游引物：5’-AGGGAAATCGTGCGTGACAT-3’，下游引物：5’-AACCGCTCGTTGCCAATAGT-3’。每个样本检测均重复3次。

1.2.8 Caspase-3活性检测胰蛋白酶消化贴壁细胞，收集至备用的细胞培养液中。600 r·min-14 ℃离心5 min收集细胞，小心吸除上清，PBS洗一次。吸尽上清后，加入裂解液冰浴裂解15 min。裂解后20 000 r·min-1离心10 min，取上清液至预冷的离心管中，加入预冷的Caspase 3底物Ac-DEVD-pNA (2 mmol·L-1)于37 ℃中孵育60 min显色。同时设定空白对照，即只加入底物不加入样品。反应结束后，用酶标仪检测样品和空白对照在405 nm处的吸光度(A值)，根据制定的标准曲线计算样品的酶活力单位。然后利用Bradford法测量待测样品的蛋白含量，计算单位质量蛋白的酶活力单位。

1.3 统计学方法采用SPSS 13.0统计学软件进行统计学分析，数据以均数±标准差表示，方差齐性资料应用单因素方差分析组间比较(Bonferroni法)，方差不齐资料采用秩和检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 槲皮素对NMDA诱导的RGC-5细胞活性的影响与对照组比较，NMDA组、NMDA+1 μmol·L-1槲皮素处理组、NMDA+10 μmol·L-1槲皮素处理组细胞活性均明显降低(均为P<0.05)，而LDH则明显升高(均为P<0.05)。与对照组比较，槲皮素处理组细胞活性和LDH水平均无明显变化(均为P>0.05)。与NMDA组比较，NMDA+10 μmol·L-1槲皮素处理组、NMDA+100 μmol·L-1槲皮素处理组、槲皮素处理组细胞活性均明显增高(均为P<0.05)，而LDH则降低(均为P<0.05)。见表1。

2.2 槲皮素对NMDA诱导的氧化应激的影响与对照组比较，NMDA组和NMDA+槲皮素处理组ROS、MDA、NO、iNOS mRNA、nNOS mRNA均明显升高，而SOD则降低(均为P<0.05)。与对照组比较，槲皮素处理组ROS、MDA、SOD、NO、iNOS mRNA、nNOS mRNA均无明显变化(均为P>0.05)。与NMDA组比较，NMDA+槲皮素处理组和槲皮素处理组细胞ROS、MDA、NO、iNOS mRNA、nNOS mRNA则降低，而SOD则升高(均为P<0.05)。见表2、表3。

组别n细胞活性/%LDH/%对照组6100.0±7.1100.0±6.3NMDA组652.3±10.2∗354.6±30.1∗NMDA+1 μmol·L-1槲皮素处理组663.1±9.5∗264.6±25.4∗#NMDA+10 μmol·L-1槲皮素处理组676.2±8.3∗#189.4±20.7∗#NMDA+100 μmol·L-1槲皮素处理组686.6±6.7#142.0±23.2∗#槲皮素处理组6109.9±11.8#95.3±8.9#F值17.31671.029P值0.0000.000

注：与对照组比较，*P<0.05；与NMDA组比较，#P<0.05

2.3 槲皮素对NMDA诱导的细胞凋亡的影响与对照组比较，NMDA组和NMDA+槲皮素处理组Bcl-2 mRNA和蛋白表达降低，而Bax mRNA和蛋白表达、Caspase-3活性升高(均为P<0.05)。与对照组比较，槲皮素处理组Bcl-2 mRNA、Bax mRNA和Caspase-3活性均无明显变化(均为P>0.05)，而Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05)。与NMDA组比较，NMDA+槲皮素处理组和槲皮素处理组Bcl-2 mRNA和蛋白表达升高，而Bax mRNA和蛋白表达、Caspase-3活性均明显降低(均为P<0.05)。见表4。

2.4 槲皮素抑制JNK/p38 MAPK信号通路活性与对照组比较，NMDA组和NMDA+槲皮素+ANISO处理组p-JNK蛋白表达升高，NMDA组和NMDA+槲皮素+P79350处理组p-p38 MAPK蛋白表达升高(均为P<0.05)。与NMDA组比较，NMDA+槲皮素处理组p-JNK蛋白和p-p38 MAPK蛋白表达降低(均为P<0.05)。与NMDA+槲皮素处理组比较，NMDA+槲皮素+ANISO处理组p-JNK蛋白表达升高(P<0.05)，NMDA+槲皮素+P79350处理组p-p38 MAPK蛋白表达升高(P<0.05)。见表5。

组别nROS/%MDA/%SOD/%NO/%对照组6100.0±4.3100.0±6.1100.0±4.3100.0±8.2NMDA组6318.5±25.6∗251.8±23.4∗52.0±9.7∗301.6±29.0∗NMDA+10 μmol·L-1槲皮素处理组6162.1±13.7∗#157.6±18.3∗#80.2±10.4∗#198.8±17.3∗#槲皮素处理组695.6±9.8#95.1±8.5#105.9±12.6#95.2±9.8#F值135.95364.23918.64487.704P值0.0000.0000.0010.000

注：与对照组比较，*P<0.05；与NMDA组比较，#P<0.05

与对照组比较，NMDA组、NMDA+槲皮素+ANISO处理组、NMDA+槲皮素+P79350处理组细胞活性明显降低，细胞凋亡率和LDH则升高(均为P<0.05)。与对照组比较，NMDA+槲皮素处理组细胞活性变化不明显(P>0.05)，而细胞凋亡率和LDH明显增加(均为P<0.05)。与NMDA组比较，NMDA+槲皮素处理组细胞活性升高，细胞凋亡率和LDH降低(均为P<0.05)。与NMDA+槲皮素处理组比较，NMDA+槲皮素+ANISO处理组和NMDA+槲皮素+P79350处理组细胞活性降低，细胞凋亡率和LDH升高(均为P<0.05)。见表6。

组别niNOS mRNAnNOS mRNA对照组61.00±0.061.00±0.08NMDA组63.02±0.25∗3.21±0.29∗NMDA+10 μmol·L-1槲皮素处理组61.98±0.14∗#2.04±0.22∗#槲皮素处理组60.98±0.07#0.96±0.10#F值124.55291.102P值0.0000.000

注：与对照组比较，*P<0.05；与NMDA组比较，#P<0.05

组别nBcl-2 mRNA/%Bcl-2蛋白/%Bax mRNA/%Bax蛋白/%Caspase-3活性/%对照组61.00±0.031.00±0.051.00±0.061.00±0.03100.0±6.8NMDA组60.42±0.10∗0.55±0.09∗2.89±0.26∗2.09±0.17∗295.4±28.9∗NMDA+10 μmol·L-1槲皮素处理组60.75±0.12∗#0.91±0.08#1.73±0.15∗#1.37±0.16∗#189.2±20.5∗#槲皮素处理组61.04±0.08#1.22±0.15∗#0.96±0.10#0.93±0.09#97.1±10.7#F值30.84927.62994.21452.48274.305P值0.0000.0000.0000.0000.000

注：与对照组比较，*P<0.05；与NMDA组比较，#P<0.05

表5 RGC-5的p-JNK、p-p38 MAPK、JNK、p38 MAPK蛋白相对表达量

组别np-JNKJNKp-p38 MAPKp38 MAPK对照组61.00±0.081.00±0.061.00±0.071.00±0.07NMDA组63.02±0.31∗1.09±0.072.98±0.13∗1.01±0.03NMDA+10 μmol·L-1槲皮素处理组60.97±0.10#1.07±0.060.98±0.11#1.09±0.11槲皮素处理组60.92±0.11#1.03±0.070.89±0.13#1.08±0.09NMDA+槲皮素+ANISO处理组63.31±0.30∗&1.04±0.071.02±0.06#1.09±0.08NMDA+槲皮素+P79350处理组61.03±0.08#1.04±0.053.01±0.27∗&1.02±0.12F值169.2580.984158.3071.042P值0.0000.6570.0000.583

注：与对照组比较，*P<0.05；与NMDA组比较，#P<0.05；与NMDA+槲皮素处理组比较，&P<0.05

组别n细胞活性/%细胞凋亡率/%LDH/%对照组6100.0±10.1100.0±10.5100.0±11.1NMDA组652.5±8.2∗302.4±30.1∗301.7±30.7∗NMDA+10 μmol·L-1槲皮素处理组684.2±12.6#170.5±20.1∗#181.2±17.6∗#槲皮素处理组689.7±10.5#158.7±17.8∗#177.5±18.3∗#NMDA+槲皮素+ANISO处理组650.2±10.3∗&315.0±28.9∗&309.5±32.3∗&NMDA+槲皮素+P79350处理组654.1±10.7∗&317.0±31.4∗&307.4±29.8∗&F值13.92146.21841.094P值0.0000.0000.000

注：与对照组比较，*P<0.05；与NMDA组比较，#P<0.05；与NMDA+槲皮素处理组比较，&P<0.05

3 讨论

视神经损伤是青光眼、糖尿病视网膜病变及年龄相关性黄斑变性等多种眼部疾病的共同结果[7]。槲皮素具有抗氧化作用，维持神经元线粒体正常形态和功能，减少β-淀粉样蛋白诱导的线粒体损伤[8]。槲皮素抑制大鼠青光眼模型以及体外培养RGC细胞凋亡、恢复线粒体功能并提高细胞存活率[9]。与之类似，本研究结果显示，NMDA处理可诱导RGC-5细胞损伤，降低细胞活性，促进LDH释放，而槲皮素则能够显著减轻NMDA导致的细胞损伤。

氧化应激是由ROS过量产生而抗氧化剂活性不足引起的，已被公认为是神经元损伤和死亡的关键因素[10]。MDA是脂质过氧化的终产物，可被用作氧化应激引起的损伤的严重程度的度量[11]。本研究发现，NMDA能显著提高培养的RGC-5细胞内氧化应激水平，槲皮素预处理显著降低了ROS和MDA的产生，并且提高抗氧化酶活性。宋海岩等[12]发现NMDA提高大鼠皮层神经元NO浓度并促进NOS表达，诱导兴奋性神经毒。本研究发现NMDA能显著增强RGC-5细胞中iNOS和nNOS mRNA的表达，促进NO的释放，槲皮素预处理能加强NMDA的诱导作用。槲皮素对NOS的调控机制目前还没有完全明确。有研究发现槲皮素通过抑制NF-κB活化，下调iNOS启动子活化和基因表达[13]。相反，也有研究发现槲皮素对NOS的活性不产生影响[14]。这也说明槲皮素在不同类型的细胞中可能发挥不同的作用。

Bax的激活使细胞色素C从膜间隙释放到细胞质中，最终激活Caspase酶，开启凋亡程序[15]。抗凋亡相关蛋白Bcl-2抑制Bax活性并阻止细胞色素C的释放。在本研究中，槲皮素预处理可降低NMDA诱导的Bax表达和Caspase-3活化，并促进Bcl-2的表达。氧化应激/ROS水平的增加可激活JNK/p38 MAPK信号[16]。研究发现槲皮素在视网膜母细胞瘤、心肌细胞、绒毛膜癌细胞中具有调节JNK/p38 MAPK信号活化的作用[15，17-18]。在本研究中，槲皮素预处理抑制NMDA诱导的JNK和p38 MAPK信号活化，应用JNK激动剂ANISO或p38 MAPK激动剂P79350预处理均可显著地抵消槲皮素的作用。这些结果提示槲皮素可能是通过调节JNK/p38 MAPK信号通路来拮抗NMDA诱导的细胞损伤。

综上所述，槲皮素呈剂量依赖性缓解氧化应激条件下RGC-5细胞的损伤，其抗氧化作用机制可能与JNK/p38 MAPK信号通路的抑制有关。