老年性白内障患者血浆LncRNA生物标志物的筛选及鉴定△

白婷婷 杜红飞 许颖

老年性白内障是一种以晶状体混浊为特征的眼部疾病，可引起患者单侧或双侧视力下降甚至失明，目前在致盲原因中居全球首位[1]。随着人口的增

长和老龄化进程的加速，老年性白内障给家庭和整个社会都带来了严重的压力和负担。目前还没有灵敏度高、特异性强的早期诊断老年性白内障的生物学指标，因此，探讨老年性白内障的发病机制，找到早期诊断的生物标志物显得尤为重要。

长链非编码RNA (long non-coding RNA，LncRNA) 是一组内源性、长度大于200 nt、不含完整开放阅读框、无或很少有蛋白编码功能的RNA分子，可通过多种方式在表观遗传学水平、转录水平及转录后水平来调节与之相关的蛋白编码基因，参与疾病的发生，这一发现开拓了LncRNA作为疾病生物学标志物和药物靶点研究的新领域。近年来有文献报道，LncRNA可通过不同机制参与许多眼部疾病的发生发展[2]。本研究应用LncRNA芯片筛选老年性白内障患者与健康老年人差异表达的LncRNA，进一步通过实时荧光定量PCR的方法进行小样本复筛，初步探讨LncRNA是否可以作为老年性白内障患者早期筛查的生物学标志物。

1 资料与方法

1.1 标本收集收集来我院就诊的老年性白内障患者15例为病例组，性别、年龄相匹配的健康老年人15例为对照组。老年性白内障的诊断标准为：年龄≥50岁，矫正视力<0.7，晶状体混浊，无其他导致视力障碍的眼病。两组均采集清晨空腹的外周静脉血2 mL置于EDTA抗凝管中，3000 r·min-1离心5 min，收集血浆置于-80 ℃冰箱保存待用。排除溶血的样本或血浆量少等不合格样本。本研究获得我院伦理委员会的批准和患者的知情同意。

1.2 LncRNA芯片分析

1.2.1 血浆总RNA的提取和质量控制随机选取病例组和对照组各5例患者的血浆分别进行混合，得到2组的混合血浆，采用Solarbio总 RNA 提取试剂盒(北京Solarbio公司)分别提取2组混合血浆的总RNA。具体步骤严格按试剂盒说明操作：取200 μL血浆加500 μL裂解液室温放置5 min，使得核酸蛋白复合物完全分离；然后加0.2 mL氯仿，离心、转移水相、洗涤；最后用50 μL RNase free ddH2O溶解，使用Agilent ND-1000检测RNA是否降解并测定RNA浓度。

1.2.2 标记、杂交及数据采集和标准化使用Arraystar RNA Flash Labeling Kit对上述溶解后的样品进行标记，然后通过Agilent SureHyb 进行杂交实验。芯片经过洗涤后，使用Agilent DNA Microarray扫描仪扫描。利用Agilent Feature Extraction软件(v11.0.1.1)采集芯片探针信号值以获得原始表达值，使用Agilent GeneSpring GX v12.1软件对信号值进行标准化。

1.2.3 差异表达分析和功能分析使用Agilent GeneSpring GX v12.1软件得到差异表达LncRNA谱。综合原始表达值与标准化信号值间的倍数(Fold Change)选择LncRNA进行小样本验证。

1.3 实时荧光定量PCR验证选取病例组与对照组各10例患者的血浆对初筛的LncRNA进行复筛。提取血浆总RNA后使用iScriptTM cDNA Synthesis Kit(美国Bio-Rad公司)进行反转录。采用20 μL体系，反应条件为25 ℃ 5 min，46 ℃ 20 min，95 ℃ 1 min，最后4 ℃保存。采用2×SsoAdvancedTM Universal SYBR Green Supermix (四川生工科技有限公司)，以 cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR。引物序列见表1，以GAPDH作为内参照。引物由四川生工科技有限公司合成。PCR反应条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。反应结束后确认扩增曲线和熔解曲线。2-△△Ct法分析LncRNA的相对表达量。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

引物名称引物序列T350772 上游引物5’-GGCTGCTCTTGAACTCCTGACC-3’T350772 下游引物5’-CGGTGGCTCACGCCTGTAATC-3’ENST00000532365 上游引物5’-GAAACGCACTGGAGAGCTGG-3’ENST00000532365 下游引物5’-AGCGTCCTGTGAGCGAAGAT-3’NR_110154 上游引物5’-GTCTAAGCTGGTGGCATGAAGAGG-3’NR_110154 下游引物5’-CAGGCAGCCTCACGATGTCTTG-3’

1.4 数据分析应用SPSS 16.0软件，采用两独立样本t检验分析3个候选差异LncRNA在病例组与对照组间的表达量。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 芯片分析结果芯片分析结果显示，病例组与对照组Fold Change 10以上，原始表达值在100以上的差异LncRNA共有91个，其中上调的有30个，下调的有61个。综合上述两个指标，选择LncRNA T350772、ENST00000532365和NR_110154进行小样本验证。

2.2 血浆中T350772、ENST00000532365和NR_110154表达的检测实时荧光定量PCR检测病例组与对照组T350772、ENST00000532365和NR_110154的相对表达量结果见表2。由表2可知，LncRNA T350772、ENST00000532365和NR_110154在病例组与对照组中的表达差异均无统计学意义(均为P>0.05)。

组别nT350772ENST00000532365NR_110154病例组101.719±0.7711.330±0.5240.8299±0.205对照组102.059±0.7671.777±0.8650.7754±0.281t值0.3090.4570.156P值0.7640.6570.878

3 讨论

白内障在我国是一种非常普遍的老年性疾病，严重影响着老年人的生活质量。它的具体发病机制尚不明确，但任何先天性或后天性的导致晶状体蛋白变性的因素都有可能导致白内障的发生。晶状体内的结构性蛋白包括α、β和γ三个家族的晶状体蛋白，这些蛋白的表达失调与结构改变很可能是导致白内障发生的直接原因[3-4]。

视觉系统的维持需要相关基因的精确表达调控、正常的细胞增殖分化与免疫应答等。异常的基因表达可能导致许多眼科疾病的发生，包括白内障、青光眼、眼部肿瘤等。近年来的研究发现，LncRNA不仅可以直接结合靶基因来激活或抑制其表达，而且还参与组蛋白修饰、染色质重塑、募集调控因子干扰转录、调节选择性剪接及蛋白质活性与定位等，在疾病的发生、发展、转归和防治上发挥重要的作用[5-6]。

目前，在其他眼部疾病中已经报道了一些LncRNA，如MIAT、H19、MALAT1等[7-10]，其中所涉及的调控机制各不相同，一般是通过多种细胞因子及信号通路来发挥作用的。虽然关于LncRNA 的研究已经取得了一些成果，但仍然处于起步阶段，还未在某一具体眼科疾病中发现有决定意义的LncRNA，从而将其作为疾病诊断的生物学标志物以及精准治疗的靶向分子。

本研究旨在寻找白内障患者的血浆中可能存在的稳定的特异性LncRNA，来作为早期诊断白内障的生物学标志物。首先我们收集白内障患者与正常人的血浆，用LncRNA芯片筛选病例组与对照组差异表达的LncRNA，然后挑选出T350772、ENST00000532365和NR_110154进一步通过实时荧光定量PCR的方法进行小样本复筛来探究其在中国老年性白内障发病过程中可能的作用。结果显示，这3个LncRNA在病例组和对照组中的表达差异均无统计学意义。

样本量较小是本研究的最大不足，结果可能存在偶然性。芯片分析在具备高通量、微阵列、大规模等优点的同时，重复性差也是不可避免的，因此可能会给筛选差异表达基因带来误差。另外病例组与对照组也可能存在其他未检测出的疾病，从而影响血浆LncRNA的表达；标本保存过程可能存在RNA的降解。所有这些因素都可能导致小样本验证与芯片检测的不符。

目前，国内外学者认为老年性白内障的发生与多种因素有关。因此，老年性白内障相关基因的鉴定非常具有挑战性，同时这也是一件意义深远的事。早期筛查老年性白内障高风险人群，可指导患者早期预防和治疗，从而避免疾病带来的不良影响。随着人们对LncRNA研究的不断深入及医学生物信息学的逐步发展，相信LncRNA在白内障预防、诊断和治疗中的作用一定会早日攻克。