乙醇对实验小鼠精子DNA完整性与精子动态参数的相关影响

（泸州医学院附属医院泌尿外科，四川 泸州 646000；医学院附属医院护理部）

当前世界范围内约15%的夫妇患有不孕不育，这与遗传、生态环境、内分泌等多种因素密切相关，而由男性精子质量下降引起者约占不孕不育人群的一半左右[1]，研究酒精对人类的生殖毒性具有重要意义。常规的精液分析能够从精子常规参数方面反映精液质量，但是其在精子功能的评价方面价值有限，不能直接反映精子受精能力和对胚胎发育的影响，而精子DNA 的完整性对男性不育是一个有价值的评估指标[2]，而精子DNA 的损伤是否与精子运动能力相互关联尚不清楚。本研究通过建立不同剂量的饮酒实验小鼠模型，观察酒精对实验小鼠精子DNA 的完整性及精子动态参数的影响，为拓宽男性不育的诊断及治疗措施提供实验依据。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用SPF 级昆明种雄性小白鼠60 只，体质量25～30 g，6～8 周龄，由湖北医药学院动物中心提供。适应性喂养一周后用于试验，饲养过程中，实验小鼠均自由采食、饮水，每天早中晚3 次喂食换水，保证充足的水、食物供应，笼中保持清洁。环境温度20～25℃，日照时间12 h。将实验小鼠随机分为4 组，每组15 只，对照组给予5 g/kg.d 蒸馏水灌胃，低、中、高剂量酒精组分别给予无水酒精（0.5 g/(kg·d）、2.5 g/(kg ·d）、5 g/(kg ·d）灌胃，连续20 周。

1.2 检测仪器 流式细胞仪、生化分析仪、722 型光栅分光光度计、MK-3 型酶标仪、计算机辅助精子分析仪、荧光显微镜等。

1.3 染色体结构分析(spermchromosomestructure analysis，SCSA)测定精子DNA 完整性 末次灌胃24 h 后采用颈椎脱臼法将实验小鼠处死，取各组实验小鼠右侧附睾组织制备精子悬液，40μL 精子悬液中加入160μL TNE buffer(0.01 mol/L Tris-cl，0.15 mol/L Nacl，1mmol/L disodium EDTA，pH=7.4)，稀释精子悬液至体积为200μL，密度1～2 ×106/mL，立刻加入400μL 酸处理液（0.08 mol/L HCL，0.15 mol/L NaCl，0.1%W/V Triton，pH=1.2）振荡混匀，30 s 后加入1.2 mL AO 染液（6μg/ml AO 溶于0.037 mol/L Citricacid，0.12 mol/LNa2HPO4，1.1 mmol/LDisodium EDTA，0.15 mol/L NaCl，pH=6.0）30 min，标本用荧光显微镜(520 nm 激发光)观察精子，用流式细胞液测定精子DNA 片段化指数（DFI）。计数每只动物200 个精子中绿色、红色和橙黄色精子数，其中绿色为DNA 双链精子、红色为DNA 单链、橙黄色为DNA 双链不稳定精子。计算出红色、橙黄色荧光精子的百分率，即为精子DNA 碎片化指数(DNA fragmentation index，DFI)，精子DNA 完整性=1-DFI。

1.4 精子动态参数的测定 末次灌胃24 h 后采用颈椎脱臼法将实验小鼠处死，取各组实验小鼠右侧附睾尾部精子，将其悬浮于精子营养液中(HBSS 中加入4.2g/L 的Hepes，0.35 g/L 的NaHCO3，2.0 g/L 的BSA，0.9 g/L 的D-glucose，0.1 g/L 的sodium pyruvate 和0.025 g/L 的soybean trypsin inhibito，pH=7.4，37℃)，使用计算机辅助精子分析仪进行分析，具体参数包括精子密度(sperm concentration)、平均速率(average path velocity，VAP)、直线运动速率(velocity straight linear，VSL)、曲线运动速率(curvilinear velocity，VCL)、精子头侧摆幅度(amplitude of lateral head displacement，ALH)、鞭打频率(beat cross frequency，BCF)、前向性(straightness，STR)、直线性(1inearity，LIN)。

1.5 统计学处理 采用SPSS17.0 软件进行统计分析，检测数据以±s 表示，采用方差分析和t 检验。

2 结果

对照组与各酒精组精子DNA 完整性与精子参数的比较详见表1。与对照组相比较，各剂量酒精组的精子DNA 完整性明显高于对照组，精子动态参数均明显减弱，具有显著性差异（P<0.01 或P<0.05）。

表1 各组精子DNA 完整性及精子动态参数比较(n=15，±s)

表1 各组精子DNA 完整性及精子动态参数比较(n=15，±s)

注：与对照组比较：*P<0.01，ΔP<0.05.

组 别 精子密度 DFI 直线运动速率 曲线运动速率 精子头侧摆幅度 鞭打频率 前向性 直线性(×106/mL) (%) (m/s) (m/s) (m) (HZ) (%) (%)对 照 组 12.86 ±6.201 1 6.11 ±4.49 4.66 ±2.861 16.1 ±2.818 3.50 ±0.706 5.04 ±0.546 62.0 ±18.285 54.6 ±4.750低剂量组 8.02 ±5.161 27.01 ±5.18* 3.9 ±2.818Δ 13.4 ±3.525 2.54 ±0.773Δ 3.56 ±0.702Δ 54.5 ±17.578Δ 48.1 ±4.143Δ中剂量组 7.63 ±4.583 31.27 ±5.65* 2.4 ±2.667Δ 10.9 ±4.232 1.92 ±0.767Δ 2.43 ±0.642Δ 32.5 ±16.163Δ 26.45 ±7.536Δ高剂量组 7.77 ±4.463 37.43 ±7.18* 2.03 ±2.55Δ 7.48 ±6.353 0.94 ±0.626Δ 1.45 ±0.616* 16.3 ±15.456Δ 18.51 ±7.628Δ

3 讨论

不育症是全球性的医学和社会性问题，在不育的夫妇当中，男性生殖能力异常者约占60%。世界卫生组织将夫妻双方均不采用任何避孕措施生活1年以上，且由于男方因素造成女方不孕者，称之为男性不育症[3]。随着生物化学技术手段的不断发展，精液分析目前已成为临床常用的评价男性生育功能的重要检测指标，而精子DNA 完整性的评价及男性附属性腺功能对男性生殖能力的影响越来越受到人们的重视[4]。

精液主要由精子和精浆组成，而精浆则是由附属性腺的分泌物组成[5]（其中约60%来自精囊，30%来自前列腺，其余10%来自于附睾和尿道球腺等）。精浆是精子的运载物，可以起到中和、缓冲和保护精子的作用，使精子可以在阴道酸性环境中存活；并为精子提供能量和营养物质。精浆里含有果糖和蛋白质，是精子的营养物质。另外，精浆中还含有前列腺素和一些酶类物质。精浆的化学成分主要有[6]：1)水：约占90%以上。2)糖类：主要是果糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖等。3)脂类：包括胆固醇、睾酮、前列腺素(脂肪酸衍生物)等。4)蛋白质：包括非酶蛋白质，如去能因子、蛋白酶抑制剂、乳铁传递蛋白、抗糜蛋白酶，抗胰蛋白酶、免疫球蛋白等；酶蛋白，包括酸性磷酸酶、透明质酸酶、糖苷酶、精素、纤溶酶原激活剂等。5)肽类激素：如FSH、LH、催乳素等。6)胺类：如精胺、亚精胺、精胺素等。7)氨基酸：如精氨酸、谷氨酸等20 多钟。8)有机酸及有机碱：如柠檬酸、肉毒碱、甘油磷酸胆碱、乳酸等。9)无机离子：如锌、镁、钙、铜、钾、氯、钠等。此外，精浆中还含有山梨醇、肌醇等。任何附属性腺的病变都会导致精浆生化指标的异常。因此，检测精浆生化指标的变化有助于了解附属性腺的分泌功能、代谢状态和病理改变等，从而为男性不育的诊断及治疗上提供依据[7]。

精子染色质结构分析法(SCSA)由Evenson 等提出[8]：用热或酸处理已液化的精子，由于受损伤和未成熟精子的鱼精蛋白巯基未发生氧化，染色质结构松散，DNA 在酸的作用下易变性成单链。吖啶橙是一种荧光络黄染料，具有高度的异染性，以插入的方式与双螺旋的DNA 分子结合，应用吖啶橙染液的异染性可对损伤和正常的精子DNA 进行区分，以评估精子DNA 的完整性。染色后断裂的精子单链DNA在荧光显微镜下呈红色荧光，而正常精子双链DNA呈绿色荧光，其结果通过流式细胞仪检测。此外，SCSA 分析所获另一项指标-高DNA 可染性(HDS)代表了呈强绿色荧光的精子百分率，可作为反映精子成熟度的指标。SCSA 参数反映了不同精子染色质构象的异质性，操作快速简便，结果直观可靠，可定量检测，便于标准化，是临床最常用的DNA 完整性检测方法[9]。细胞核DNA 是精子的主要遗传物质，其完整性是遗传物质正确传递给子代的前提，对于子代的繁衍具有重要意义，在受精和胚胎发育中发挥重要作用。在人类精子发生过程中，染色质的DNA结合蛋白主要为鱼精蛋白，其在分子内外能够形成二硫键交联，具有保护精子DNA 完整性，使DNA 免受损伤的作用。但是，在正常和不育男性精液中，均存在一定程度的精子DNA 损伤。有研究报道精子DNA 损伤会对自然生育和辅助生殖技术治疗结局产生负面影响，并与复发性流产相关。自然受孕过程中，DNA 受损的精子几乎不可能与卵子成功结合并完成受精。研究表明，DNA 损伤程度与自然受孕率呈显著负相关，如果男性精子DNA 损伤率>30%，则自然生育的可能性几乎为零[10]。精子DNA 损伤的机制尚不明确，可能是多种因素共同作用的结果。例如：精子发生过程中染色质组装异常，精子在发生及生殖道转运过程中遭受毒物和氧化应激的损伤，以及精子细胞异常凋亡等。精子DNA 损伤分析是比传统精液常规分析参数更稳定、更敏感地预测男性生育能力的指标。精子DNA 完整度分析区别不育和生育能力正常的特异度为89.4%，敏感度为96.9%，这提示精子染色质或DNA 完整性可能是精子质量的独立预测指标，作为精子质量临床评价标准具有优越的可行性[11]。

精子动态参数是精子许多功能的一种综合而直观的表现，是正常生理状态下完成受精过程的基础，是评价成熟精子功能的重要指标之一，对评价生育能力十分重要[12]。本研究显示各酒精组实验小鼠在直线运动速率、精子头侧摆幅度、鞭打频率、前向性、直线性方面较对照组均有明显减弱，说明酒精对精子的活动能力方面有着明显的影响。

酒精是亲脂性的小分子物质，其代谢产物乙醛能与各种蛋白质结合，形成乙醛-蛋白质毒物[13]，此毒物可抑制蛋白质的合成，干扰细胞膜中类脂和蛋白结构，导致细胞功能障碍。结果表明，1)与对照组相比较，各剂量酒精组的精子DNA 完整性明显高于对照组，差异具有显著性差异（P<0.01）。2)各酒精组实验小鼠在直线运动速率、精子头侧摆幅度、鞭打频率、前向性、直线性方面较对照组均有明显减弱，差异具有统计学意义（P<0.05 或P<0.01）。说明酒精一方面直接作用于睾丸，使生精细胞退化变性，精子产生受到抑制，精子质量和活动能力下降，另一方面直接或间接地作用于附属性腺，使精子失去精浆对其的能量供应、稳定染色质及减少氧自由基伤害等作用[14]，从而进一步影响睾丸的生殖能力，导致不育的发生。

[1]Chen SS，Huang WJ.Differences in biochemicai markers and body mass index between patients with and without varicocele[J].Chin Med Assoc，2010，73（4）:194-198.

[2]Sakkas D，Alvarez JG，Sperm DNA fragmentation：mechanisms of orogin，impact on reproductive outcome，and analysis[J].Fertil Steril，2010，93(4)：1027-1036.

[3]Eisenberg ML，Lipshultz LI.Varicocele-induced infertility；Newer insightsintoitspathophysiology[J].Indian JUrol，2011，27（1）：58-64.

[4]Camejo MI，Abdala L，Vivas-acedog，et al，Selenium，copper and zinc in seminal plasma of men with varicocele，relationship with seminal parameters[J].Biol Trace Elem Res，2011，34（2）：68-72.

[5]Giwercman A，Lindstedt L，Larsson M，et al.Sperm chromatin structureassay as an independent predictor of fertility in vivo：acase-control study[J].International Journalof Andrology，2010，33(1)：221-227.

[6]Baazeem A，BelzileE E，Ciampi A，et al.Varicocele and male factor infertility treatment:a new meta-analysis and review of the role of varicocelerepair[J].Eur Urol，2011，60（4）：796-808.

[7]Robin G，Boitrelle F，Leroy X，et al.Assessment of azoospermia and higical evaluation of spermatogenesis[J].Annales de Pathologize，2010，30（3）：182-195.

[8]Soudabeh S，Ardekani AM，Hodjat M，et al.Comparing seminal plasma biomarkers between normospermic and azoospermic men[J].J Reprod Infertil，2010，11（1）：39-46.

[9]曾兰，李运星，叶飞.精子DNA 损伤在生殖医学中的研究[J].中国计划生育杂志，2010，9(1)：60-62.

[10]宋学茹，江珊，白晓红，等.精子DNA 完整性检测的临床应用[J].国际生殖健康/计划生育杂志，2011，30(1)：61-64.

[11]世界卫生组织.人类精液检查与处理实验室手册[M].北京：人民卫生出版社，2011：2.

[12]郭名和，郭晓春，邵永.解脲支原体感染对精液中精浆生化成分及精子顶体完整性的影响[J].检验医学与临床，2011，8（13）：1586-1588.

[13]黄学锋，金建远，费前进，等.精子DNA 损伤：独立的精子质量评价指标[J].温州医学院学报，2010，40（3）：239-241.

[14]Madani AH，Falahatkar S，Heidarzadeh A，et al.Sensitivity and specificity of serum FSH and testis size in predicting the existence of spermatogenesis in azoospermic infertile men[J].Andrologia，2011，25（10）：1439-1442.