甘肃和内蒙古地区马铃薯晚疫病菌的致病型

韩 淼，汪晓雯，黄 琛，朱小琼，国立耘

(中国农业大学植物病理学系，北京 100193)

甘肃和内蒙古地区马铃薯晚疫病菌的致病型

韩 淼，汪晓雯，黄 琛，朱小琼，国立耘*

(中国农业大学植物病理学系，北京 100193)

利用来自国际马铃薯中心含有单显性抗性基因的11个鉴别寄主，采用离体叶片测定方法对2007—2008年采自甘肃和内蒙古地区的共91个致病疫霉马铃薯分离物的致病型进行了测定。结果显示：来自甘肃的65株菌中共有28个致病型，有3株可以克服11个抗性基因；总共有超过一半的菌株对抗性基因R7、R9、R11有毒性，而能克服抗性基因R1、R2、R8的菌株数最少。在来自内蒙古的26株菌中，共检测到24个致病型，有2株菌能克服11个抗性基因，共有84.6%的菌株可以对含有抗性基因R7的植株表现出毒性，而R1、R2、R8被克服比例最低。因此，研究结果表明，在这两个地区可优先考虑在菌株采集地种植和选育含有R1，R2和R8这3个抗性基因的马铃薯品种。

马铃薯； 马铃薯晚疫病菌； 致病型； 鉴别寄主

致病疫霉(Phytophthorainfestans)引起的马铃薯晚疫病是马铃薯生产中的主要病害之一，病原菌能在短时间内引起寄主块茎、茎、叶等腐烂，造成巨大的经济损失[1]。该病害在我国马铃薯各大主产区均有发生[2]，是制约我国马铃薯产业发展的一个重要因素。

致病疫霉是异宗配合的卵菌，通常通过A1和A2两种交配型进行有性生殖。在过去的30年中，该病害在多国严重发生。国际贸易中引起的致病疫霉群体通过国际迁移发生导致的包括出现A2交配型和抗药性菌株群体结构的复杂性增加，被认为是该病害在各地严重发生的主要原因[1]。近些年，中国多地出现了自育菌株[2-3](即菌株在单独培养的条件下可产生具有活性的卵孢子)[3]。自育菌株的出现使田间马铃薯晚疫病菌发生有性生殖的几率增大，而有性生殖产生的基因重组是增加病菌种群多样性的重要途径。研究已发现自育菌株出现的区域的群体基因型多样性显著高于未发现自育菌株的地区[3]，但是，群体基因型多样性的增加是否对病原菌的致病性产生影响还有待研究。晚疫病的发生符合基因对基因假说[4]，所以病原菌无毒基因与寄主抗病基因互作决定了病害的发生。根据基因对基因假说，抗病基因即R基因编码的蛋白识别对应的无毒基因编码的蛋白效应物从而导致过敏性坏死反应(hypersensitive reaction)。基于此识别反应，晚疫病的马铃薯鉴别寄主可用于马铃薯晚疫病菌菌株的致病型检测。该检测不仅可以反映出菌株间的致病性差异，还能反映出毒性基因的分布和比例，对病原菌群体致病型结构的了解是制定有效防治策略的基础。

甘肃省和内蒙古自治区是中国最重要的种薯和商品薯生产地，也是晚疫病的常发区。做好马铃薯种薯产地的晚疫病防治是保证马铃薯商品薯高产的前提。本研究的目的是明确甘肃和内蒙古地区马铃薯晚疫病菌群体中的致病型种类及其分布。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：2007年采自甘肃省十个地区的马铃薯晚疫病菌株65株和2008年采自内蒙古地区的马铃薯晚疫病菌株26株(表 1)。

表1马铃薯晚疫病菌菌株来源及不同地区的致病型类型

Table1OriginsofthePhytophthorainfestansisolatesandthevarianceofpathotypesindifferentregions

年份Year地点Location菌株数No．ofisolates交配型Matingtype致病型数No．ofpathotypeSSR基因型数No．ofgenotypes2007定西Dingxi，Gansu7A143东乡平Dongxiangping，Gansu4A133会川Huichuan，Gansu11A199临夏Linxia，Gansu5A142岷县Minxian，Gansu4A144天水Tianshui，Gansu19A1，自育1213永登Yongdeng，Gansu2A122渝中Yuzhong，Gansu5A142渝中上庄Yuzhongshangzhuang，Gansu3A123庄浪Zhuanglang，Gansu5A1432007集宁Jining，InnerMongolia2A11-2008呼和浩特Huhhot，InnerMongolia19A1，自育18-乌兰察布Ulanqab，InnerMongolia2A12-武川Wuchuan，InnerMongolia3A13-Total 91

植物材料：含有单个抗性基因R1-R11的11个鉴别寄主的组培苗，感病品种‘夏波蒂’(‘Shapody’)作为对照。

1.2 方法

1.2.1 鉴别寄主的准备

MS培养基配方如下。

大量元素(母液Ⅰ)： NH4NO333g/L；KNO338 g/L；CaCl2·2H2O 8.8 g/L； MgSO4·7H2O 7.4 g/L；KH2PO43.4 g/L。

微量元素(母液Ⅱ)：KI 0.166g/L；H3BO 1.240g/L；MnSO4·4H2O 4.460g/L；ZnSO4·7H2O 1.720g/L； NaMoO4·2H2O 0.05 g/L；CuSO4·5H2O 0.005 g/L； CoCl2·6H2O 0.005 g/L。

铁盐(母液Ⅲ)：FeSO4·7H2O 5.560g/L；Na2-EDTA·2H2O 7.460g/L。

有机成分(母液Ⅳ)：ⅣA肌醇 20g/L；ⅣB烟酸0.100g/L；盐酸吡哆醇(维生素B6)0.100g/L；盐酸硫胺醇(维生素B1)0.100g/L；甘氨酸0.400g/L。

以上各种营养成分的用量，除了母液Ⅰ为20倍浓缩液外，其余的均为200倍浓缩液。

组培苗茎段移植在MS培养基中培养3～5周后，将其移栽至营养土草炭土和蛭石以1∶1比例的混合物中。移栽后用保鲜膜覆盖住培养盒，3～5 d后可将保鲜膜揭开，于18～25 ℃温室中L∥D=16h∥8 h条件下培养。待组培苗长出7～10片复叶时即可采集叶片用于接种鉴定。

1.2.2 游动孢子悬浮液的制备

将待测菌株的菌丝块接种于黑麦番茄培养基上[2]，在18 ℃条件下黑暗培养7～10d。用无菌水将游动孢子囊洗下，并将菌丝等杂质过滤掉。之后将游动孢子囊悬浮液调至浓度为5 × 104个/mL，收集到的孢子囊悬浮液放入4 ℃下培养3h以促进游动孢子释放，接种工作应在1h之内完成，以免游动孢子丧失活性。

1.2.3 接种方法

采用离体叶片测定的方法。在培养皿中放入直径9 cm的滤纸，加入无菌水润湿滤纸，以保持培养皿内部的相对湿度在90%以上。采集待测鉴别寄主植株的中部叶片，背面朝上放入培养皿中，每个培养皿中3～4片叶，每个叶片接种不同菌株。将待测菌株的游动孢子悬浮液接种于叶片背面，每个叶片接种10μL，每个菌株设4个重复，随机分布在不同皿中。接种后在18～19 ℃下暗培养12～24 h，14～16h/d光照(2000～4000lx)继续培养4～7 d。接种后的第4～7天开始观察和记录检测结果，所有的试验在独立的条件下重复2～3次。

1.2.4 病情调查

叶片发病病级采用如下分级方法(图1)。

图1 致病型测定的分级标准Fig.1 Classification standard of pathotype testing

0级：无侵染症状。

1级：典型的过敏性反应；肉眼可见微小病斑、黑色坏死，一般仅局限于接种位点，无明显扩展，病斑边缘无失绿晕环，无菌丝体和孢子囊产生。连续观察4～7 d，结果相同；延长培养时间后，镜检确认叶片表面无菌丝体和孢子囊形成。

2级：限制性病斑;肉眼可见较明显的限制性病斑、黑色坏死，一般仅局限于接种位点及有限邻近区域，病斑不能跨越二级叶脉，病斑边缘无失绿晕环，无或极少有菌丝体和孢子囊产生。延长培养时间后，镜检确认叶片表面菌丝体稀少，无或极少有孢子囊形成。

3级：典型的扩展性水浸状病斑;肉眼可见接种部位及附近、甚至整个叶片成水浸状，表面有大量菌丝体产生、大范围蔓延，病斑形状不规则，病斑组织变黑坏死尚不明显，边缘有明显的失绿晕环。病斑扩展显著、可跨越二级叶脉和主叶脉，形状不断变化，显微观察可见大量菌丝体和孢子囊的形成。

其中，0<平均病级≤2为抗性反应(resistant)，平均值>2为感病反应(susceptible)即供试菌株含有相应的毒性基因。根据Black等[5]的方法确定菌株的致病型类型。

2 结果和分析

通过检测，发现来自甘肃省10个地区的65株马铃薯晚疫病菌中，共有28个致病型(表2)。其中，天水地区的19株菌分属12个致病型；会川地区的11株菌属于9个致病型。在发现的28个致病型中，0致病型最多，占25%。其次是致病型7.9.11，发生频率为15.6%。共检测到3个菌株对所测11个寄主均表现为毒性，属于所谓的“超级致病型”，之前的研究发现其SSR基因型均为3[3](表1)。来自内蒙古地区的26株马铃薯晚疫病菌菌株中共有24个致病型(表2)，所有致病型所占比例都很低，未发现优势致病型，有2株菌属于超级致病型。结合之前对甘肃省十个地区的致病疫霉群体的SSR基因型研究结果[3]，采用Pearson相关系数对2007年采自甘肃地区的菌株SSR基因型种类和致病型种类进行相关性分析，结果显示晚疫病菌致病型多样性与SSR基因型多样性存在一定的正相关性(P<0.01)，即基因型种类较多的地区其致病型种类也较丰富。

研究还发现来自甘肃的菌株中，分别有64.5%、51.6%、50.0%的菌株对含有R7、R9、R11的植株表现出毒性(图2)。其次是对R4、R10表现毒性的菌株比率分别为22.6%和33.9%。对R3、R5、R6表现毒性的比例分别为17.7%、16.1%、17.7%，而能克服R1、R2、R8的菌株比率最低，均为8.1%。

来自内蒙古的菌株群体中，超过一半的菌株可以克服R7(84.6%)、R9(69.2%)、R10(53.8%)、R11(76.9%)。克服R3、R4、R5、R6菌株比例相对较低，分别为46.2%、42.3%、34.6%、42.3%。仅有23.1%、15.4%、15.4%的菌株可以克服抗性基因R1、R2和R8(图2)。

图2 甘肃和内蒙古地区马铃薯晚疫病菌分离物克服11个寄主抗性基因的比例Fig.2 Frequency of compatible interaction of Phytophthora infestans from Gansu and Inner Mongolia defeating R genes in 11differentials

表2 甘肃和内蒙古马铃薯晚疫病菌群体的致病型种类及其频率Table 2 Pathotype structure and percentages of Phytophthorainfestans population in Gansu and Inner Mongolia

3 讨论

本研究从采自甘肃和内蒙古的91株马铃薯晚疫病菌中共检测到45个致病型，表明这两个地区的马铃薯晚疫病菌的致病型种类丰富。其中在来自甘肃天水地区的19株菌(4株A1型菌株，15株自育型菌株)中鉴定出17种致病型；之前的研究也发现天水地区的SSR基因型多样性指数是在甘肃地区中最高的[3]。天水地区是甘肃省重要的种薯培育基地，该地马铃薯品种繁多，病原菌群体受到的选择压力高，同时，自育菌株的存在也可能是导致该地马铃薯晚疫病菌菌株群体结构非常复杂的一个原因。

研究中发现，超过一半的菌株在抗性基因R7、R9、R11的植株上表现为毒性；抗性基因R1、R2和R8被克服比例最低。因此，培育含有R1、R2和R8的马铃薯品种用于晚疫病的防治在该地区仍然是可行的。姚裕琪等[6]1995年用7个单基因寄主，5个双基因寄主和3个双基因寄主在内蒙古呼市检测到5种致病型；郭军等[7]在1997-1999年和2002-2003年采自内蒙古地区的38个致病疫霉菌株中发现了18个致病型。2009年，成兰芳等[8]从甘肃地区采集的63株菌中发现了16种致病型。由此可见，甘肃和内蒙古地区的马铃薯晚疫病菌的致病型结构呈现出多样性和复杂性。因此，今后应加强对该地区晚疫病菌致病型组成及群体结构的监测和研究。

超级致病型(或超级生理小种)，即对所有11个公认的含有单显性抗性基因的寄主均表现为毒性的菌株历来是对马铃薯晚病菌菌株群体检测的重要目标之一。本研究中从来自甘肃和内蒙古的马铃薯晚疫病菌菌株群体中均检测到超级致病型。自2000年以来，欧洲地区也相继发现超级致病型，根据目前EUROBLIGHT (http:∥euroblight.net/)的整理，比利时、爱沙尼亚、北爱尔兰和荷兰都已发现超级致病型，但是超级致病型的比例占所测菌株的比例仍然较低，除北爱尔兰8%左右，其他国家的均低于5%。此前，在内蒙古自治区(5株菌，2003年)[7]、云南省[9-10]、四川省(2株，2006-2008年)以及黑龙江省和吉林省(18株，2009年)[11]均被检测到，比例仍然较低，这一结果与此前欧洲的发现相似。

致病型测定虽然是目前普遍采用的检测菌株对寄主植物毒性反应的方法，但是，该方法不仅耗时长，而且需要标准的含有单显性基因的专用寄主。本研究的结果显示晚疫病致病型的多样性与群体遗传多样性存在一定的正相关性，且目前发现的超级致病型的多为SSR基因型3。因此，SSR 标记可以作为监测的辅助工具。

综上所述，测定马铃薯晚疫病菌菌株群体的致病型类型和分布，以及借助SSR 标记快速发现潜在的超级致病型只是田间菌株群体监测的基础，根据该地的致病型结构，合理进行马铃薯抗病品种的培育及布局，应该作为今后的主要防治策略之一。

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PathotypesofPhytophthorainfestansisolatesinGansuandInnerMongolia

Han Miao, Wang Xiaowen, Huang Chen, Zhu Xiaoqiong, Guo Liyun

(DepartmentofPlantPathology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China)

A determination was performed to figure out the distribution ofPhytophthorainfestanspathotypes in Gansu and Inner Mongolia by using 11differentials of potato lines carrying resistance (R) genes.The results showed that among the 65 isolates collected from Gansu,28 pathotypes were detected,of which pathotype 0and pathotype 7.9.11were the most frequent,while the frequencies ofVir1,Vir2 andVir8 were the lowest.Three isolates could infect all 11differentials.In Inner Mongolia,a total of 24 pathotypes were distinguished,among which two isolates defeated all 11R genes.The frequencies ofVir1,Vir2 andVir8 were the lowest.According to the results,potato cultivars carryingR1,R2 andR8 are recommended for these regions.

potato;Phytophthorainfestans; pathotype; differential

2013-04-27

：2013-06-18

公益性行业(农业)科研专项(3-20)

S 435.32

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.02.029

致谢：感谢云南师范大学李灿辉老师提供的R1-R11的鉴别寄主。

* 通信作者 E-mail:ppguo@cau.edu.cn