不同真菌发酵豆渣营养品质与功能特性研究

张蒙冉，李淑英，高雅鑫，侯丽真，侯旭杰，王凤忠*

（1 塔里木大学生命科学学院 南疆特色农产品深加工兵团重点实验室 新疆阿拉尔 843300 2 喀什大学 新疆喀什 844000 3 中国农业科学院农产品加工研究所 农业农村部农产品加工综合性重点实验室 北京 100193）

大豆是我国四大主栽作物之一，富含蛋白质、氨基酸、脂肪及大豆异黄酮等营养功能成分，是多种优质营养素的来源[1]。其中，蛋白质含量为35%～42%，氨基酸比例与人体需求相近[2]；脂肪含量为16%～22%，其中80%为不饱和脂肪酸，具有降低胆固醇和预防动脉粥样硬化的作用[3]；异黄酮含量为0.5%～7.0%，主要分为结合型糖苷和游离型苷元，结合型糖苷占比为97%～98%，不易被人体吸收利用，而游离型苷元占比为2%～3%，较易被人体吸收利用，具有抗氧化、抗菌，防止心血管疾病及抗癌等作用[4]。

大豆富含优质的植物蛋白，常被用作加工豆制品。豆渣是大豆加工豆制品过程中产生的副产物，富含大豆的营养功能成分，如豆渣中蛋白质含量为20%～25%、脂肪含量为8%～11%、大豆异黄酮含量为0.1%～6.5%[5]，具有较高的应用价值和开发潜力。我国是大豆加工和消费的大国，每年产豆渣的数量惊人。截止至2020年，中国大豆年消费量超过1 亿t，其中每年用于豆制品加工的大豆约为2 000 万t，按照加工1 t 干大豆产生2 t 湿豆渣计算，湿豆渣的年产生量在4 000 万t 以上[6]。大部分豆渣被当作废弃物丢弃，其含水量极高（70%～80%），极易腐败变质，造成严重的环境污染和资源浪费[7]；少部分豆渣被干制后当作饲料利用，高温干制既增加了能耗，又使其营养成分大量流失[8]；还有个别地区极少部分豆渣被作为食品原料直接食用，其口感粗糙，受众人群较少[9]。

微生物发酵是实现豆渣高附加值转化的有效途径，如豆渣是制备酱油的主要原料，也是发酵法制备高附加值生物饲料的主要成分[10]。微生物发酵可将豆渣中蛋白、脂肪等大分子物质转化为氨基酸和脂肪酸等小分子物质，可有效增加豆渣的营养品质和消化吸收利用率[11]；同时也可将异黄酮由结合型糖苷转化为游离型苷元，增加其功能特性[12]。微生物对豆渣的转化能力与其自身代谢能力相关，实现豆渣的高效利用，关键在微生物[13]。通过选用合适的菌种，以发酵的方式改善豆渣的营养功能成分，提高其营养价值，开发新型豆渣产品是一条有效的应用途径。

实验室前期筛选出3 株（少孢根霉FW-1、白地霉FW-2、无接合孢子根霉FW-3）适用于大豆发酵的真菌，通过液体发酵豆渣方式探索这3 株菌对其营养成分的转化效率，以期为豆渣的高附加值利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备

豆渣，市售；少孢根霉FW-1、白地霉FW-2、无接合孢子根霉FW-3，实验室-80 ℃保藏菌种。马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA、马铃薯葡萄糖肉汤PDB、甲基红指示剂、溴甲酚绿指示剂、硼酸、硫酸、催化剂片（硫酸铜、硫酸钾）、95%乙醇、氢氧化钠、甲醛、盐酸、苯酚、柠檬酸钠、无水乙醚、石油醚、氯化钠、乙酰氯、碳酸钠、氢氧化钾等试剂均购于国药集团化学试剂有限公司；氮气：纯度99.9%，北京萃锋科技有限公司。

LHS-150SC 恒湿恒温箱、TS-300DC 恒温摇床，上海天呈实验仪器制造有限公司；YQ205-09凯氏定氮仪，意大利VELP 公司；L-8900 氨基酸分析仪，HITACHI 公司；E-816 索氏提取器，瑞士AG 公司；G7318AA 气相色谱仪、1220 Infinity ⅡLC 高效液相色谱仪，安捷伦科技（中国）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 发酵豆渣的制备

1.2.1.1 种子液制备 将-80 ℃保存的菌株FW-1、FW-2、FW-3 涂布于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，28 ℃培养36 h 进行活化；取活化好的菌丝体接种至100 mL 马铃薯葡萄糖肉汤 （PDB）培养基中，28 ℃、210 r/min 摇床培养2～3 d，进行二次活化；5 500 r/min 离心15 min 收集菌体，无菌水定容1 g/mL 作为种子液备用。

1.2.1.2 豆渣发酵

1） 发酵培养基制备 取5.5 g 豆渣，加44 mL 水（料液比1 ∶8）匀浆，加2 g 淀粉混匀，调节pH 4.5，定容50 mL，并转移至250 mL 三角瓶中（装液量20%），121 ℃、0.1 MPa 灭菌15 min，冷却备用。

2） 豆渣发酵 按1%接种量将3 种菌的种子液接入发酵培养基中，30 ℃、210 r/min 摇床培养；分别于48，72 h 和96 h 取样，以接菌前未发酵豆渣为对照，真空冷冻干燥备用。

1.2.2 营养成分分析

1.2.2.1 蛋白质含量的测定 参考GB 5009.5-2016 《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》第一法凯氏定氮法测定。

1.2.2.2 肽含量的测定 参考GB 5009.235-2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》第一法酸度计法测定。

1.2.2.3 氨基酸含量的测定 参考GB 5009.124-2016 《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》中的方法测定。

1.2.2.4 脂肪含量的测定 参考GB 5009.6-2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》 第一法索氏抽提法测定。

1.2.2.5 脂肪酸含量的测定 参考GB 5009.168-2016 《食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》第二法外标法中乙酰氯-甲醇法测定。

1.2.3 功能成分分析 异黄酮含量的测定参考GB/T 23788-2009《保健食品中大豆异黄酮的测定方法 高效液相色谱法》中的方法。

1.3 数据处理

每组试验重复3 次，使用Excel 2016 软件进行数据处理，使用GraphPad Prism 7 软件进行图表处理。

2 结果与分析

2.1 营养品质分析

2.1.1 蛋白质的代谢变化规律分析 蛋白质是豆渣的主要营养成分之一，在微生物丰富的蛋白酶的作用下，蛋白质代谢成肽，肽代谢成氨基酸，可极大地增加豆渣的营养品质和消化吸收利用率。本论文通过检测3 株菌发酵豆渣过程中蛋白质、肽和氨基酸的含量变化，分析3 株菌对豆渣蛋白质的转化效率。

3 株菌发酵豆渣过程中，蛋白质、肽和氨基酸的含量变化如图1所示。由图1a 和1d 可知，3 株菌发酵过程中，蛋白质含量整体呈现下降趋势。96 h 时，FW-1、FW-2、FW-3 豆渣发酵液中的蛋白质含量依次为19.94，20.31，20.95 g/100 g，与未发酵豆渣（22.70 g/100 g）相比，蛋白质的降解率分别为12.2%，10.5%和7.7%。由图1b 和1e 可知，3 株菌发酵过程中，肽整体呈现下降趋势。96 h 时，FW-1、FW-2、FW-3 豆渣发酵液中的肽含量依次为2.97，3.23，3.35 g/100 g，与未发酵豆渣（3.97 g/100 g） 相比，肽的降解率分别为25.2%，18.6%和15.6%。由图1c 和1f 可知，3 株菌发酵过程中，氨基酸整体呈现上升趋势。96 h 时，FW-1、FW-2、FW-3 豆渣发酵液中的氨基酸含量分别为20.88，21.15，20.80 g/100 g，与未发酵豆渣（18.91 g/100 g）相比，氨基酸的上升率分别为10.4%、11.8%和10.0%。由以上结果可知，豆渣在3 株菌地发酵作用下，蛋白质和肽被降解为氨基酸，极大地提高了豆渣的营养品质。对豆渣蛋白质和肽降解效率最高的是FW-1，其次为FW-2 和FW-3。

图1 3 株菌发酵豆渣的蛋白代谢变化分析Fig.1 Analysis on the changes of protein metabolism in fermented soybean dregs of three strains of bacteria

2.1.2 必需氨基酸含量分析 人体对蛋白质的吸收利用是以氨基酸的形式体现，其中必需氨基酸是人自身不能合成，需从食物中获得的，摄入不足会导致大脑和内脏器官受损，血液系统、免疫系统功能下降[14]。蛋白质营养价值是由必需氨基酸组分的种类、含量及各组分所占的比例决定。在微生物的发酵作用下，大豆蛋白和肽降解形成氨基酸，提高了必需氨基酸的含量，增加豆渣的生物利用度和功能特性。本文通过检测3 株菌发酵过程中必需氨基酸含量的变化，分析3 株菌发酵豆渣的营养品质及其变化规律。

3 株菌发酵豆渣过程中，必需氨基酸的含量变化如图2所示。由图2a 和2b 可知，3 株菌发酵过程中，必需氨基酸整体呈现上升趋势。96 h 时，FW-1、FW-2、FW-3 豆渣发酵液中的必需氨基酸含量分别为8.43，8.21，8.26 g/100 g，与未发酵豆渣（7.51 g/100 g）相比，必需氨基酸的上升率分别为12.3%，9.3%和10.0%。由以上结果可得，豆渣在3株菌地发酵作用下，豆渣蛋白质营养价值显著提高。就氨基酸的营养品质变化而言，最优的发酵菌种为FW-1，其次为FW-3 和FW-2。

图2 3 株菌发酵豆渣的必需氨基酸含量变化分析Fig.2 Analysis on the change of essential amino acid content of fermented soybean dregs with three strains of bacteria

2.1.3 脂肪的代谢变化规律分析 脂肪是豆渣的另一大主要营养成分，在微生物中丰富的脂肪酶的作用下，脂肪代谢成脂肪酸，极大地增加了豆渣的营养品质和消化吸收利用率。本文通过检测3株菌发酵过程中脂肪和脂肪酸的含量，分析3 株菌对豆渣脂肪的转化效率。

3 株菌发酵豆渣过程中，脂肪和脂肪酸的含量变化如图3所示。由图3a 和3c 可知，3 株菌发酵过程中，脂肪含量整体呈现下降趋势。96 h 时，FW-1、FW-2、FW-3 豆渣发酵液中的脂肪含量依次为3.48，1.32，2.22 g/100 g，与未发酵豆渣（10.1 g/100 g） 相比，脂肪的降解率分别为65.5%，86.9%，78.0%。由图3b 和3d 可知，3 株菌发酵豆渣过程中，脂肪酸含量整体呈现上升趋势。96 h时，FW-1、FW-2、FW-3 豆渣发酵液中的脂肪酸含量依次为10.60，7.16，15.11 g/100 g，与未发酵豆渣（4.59 g/100 g） 相比，脂肪酸含量分别增加了1.3倍、0.6 倍和2.3 倍。综上所述，豆渣在3 株菌的发酵作用下，脂肪被降解为脂肪酸，极大地增加了豆渣的营养品质。豆渣脂肪降解效率最高的是FW-2，其次为FW-3 和FW-1。豆渣脂肪酸合成效率最高的是FW-3，其次为FW-1 和FW-2。

图3 3 株菌豆渣发酵的脂肪代谢变化分析Fig.3 Analysis on fat metabolism of three strains of fermented soybean dregs with three strains of bacteria

2.1.4 不饱和脂肪酸的含量分析 不饱和脂肪酸是维持人体健康的必须营养素，其组成和含量是影响其营养价值的重要因素。不饱和脂肪酸被称为人体的必需脂肪酸，不能由人体自身合成，然而，在人体正常运转的过程中却是不可或缺的，必须从食物中摄入。不饱和脂肪酸可以促进人体内胆固醇的代谢，对降血脂、抗炎、抗肿瘤和预防心脑血管疾病等具有一定的作用[15]。本文通过检测豆渣发酵过程中不饱和脂肪酸含量变化，分析3株菌对豆渣脂肪的转化效率。

在3 株菌发酵豆渣的过程中，不饱和脂肪酸的含量变化如图4所示。由图4a 和4b 可知，不饱和脂肪酸呈现上升趋势。96 h 时，FW-1、FW-2、FW-3 豆渣发酵液中的不饱和脂肪酸含量依次为8.48，5.57，12.51 g/100 g，与未发酵豆渣（3.54 g/100 g）相比，不饱和脂肪酸分别增加了为1.4 倍、0.6倍和2.5 倍。由以上结果可知，豆渣在3 株菌发酵作用下，不饱和脂肪酸中各个组成成分均显著增加。就脂肪酸的营养品质变化而言，不饱和脂肪酸转化效率最高的是FW-3，其次为FW-1 和FW-2。

图4 3 株菌发酵豆渣的不饱和脂肪酸含量变化分析Fig.4 Analysis on the change of unsaturated fatty acid content of fermented soybean dregs with three strains of bacteria

2.2 功能成分的分析

异黄酮是豆渣主要功能成分之一，在微生物丰富的β-葡萄糖苷酶作用下，异黄酮由糖苷型转化成苷元型，发生量效的改变，可极大地增加豆渣的功能特性。本论文通过检测3 株菌发酵过程中糖苷型、苷元型异黄酮含量变化，分析3 株菌对豆渣异黄酮的转化效率。

3 株菌发酵豆渣过程中，糖苷型和苷元型异黄酮含量变化如图5所示。由图5a 和5c 可知，3 株菌发酵过程中，糖苷型异黄酮整体呈现下降趋势。96 h 时，FW-1、FW-2、FW-3 豆渣发酵液中的糖苷型异黄酮含量依次为0.047，0.043，0.036 g/100 g，与未发酵豆渣（0.095 g/100 g）相比，糖苷型异黄酮的降解率分别为50.5%，54.7%和62.1%。由图5b和5d 可知，3 株菌发酵过程中，苷元型异黄酮整体呈现上升趋势。96 h 时，FW-1、FW-2、FW-3 豆渣发酵液中的苷元型异黄酮含量依次为0.051，0.052，0.056 g/100 g，与未发酵豆渣（0.005 g/100 g）相比，苷元型异黄酮分别增加了9.2 倍、9.4 倍和10.2 倍。由以上结果可得，豆渣在3 株菌发酵作用下，异黄酮由结合型糖苷型转化为游离型苷元，对改善豆渣功能特性起到了显著效果。对豆渣异黄酮构型修饰转化效率最高的是FW-3，其次为FW-2 和FW-1。

图5 3 株菌发酵豆渣的异黄酮代谢分析Fig.5 Analysis of isoflavone metabolism in fermented soybean dregs of three strains of bacteria

3 讨论

伴随我国豆制品庞大的加工规模而来的是加工副产物的利用问题，豆渣作为豆制品加工的主要副产物，实现其高值化利用一直以来备受关注。随着大豆产业的振兴计划的提出，提高豆渣的生物利用率，缓解饲料产业对大豆蛋白的需求量，对于有效应对中美贸易摩擦显得尤为重要。近年来，我国在豆渣食品高值化利用研究方面取得了一定进展，运用微生物发酵技术改善了豆渣食品的风味、口感和食用性能[16]。李艳芳等[17]利用黑曲霉和米曲霉发酵豆渣，降低了豆渣粒度分布进而改善其口感，增加可食性；刘晓庆等[18]的研究发现，经过曲霉发酵后的豆渣曲，成块均匀且富有弹性，口感细腻，无豆腥味，与传统豆酱风味和口感相差不大。本研究以实验室保藏的3 株菌发酵豆渣，系统分析了豆渣中主要营养物质和功能成分的变化规律，结果显示3 株菌发酵豆渣的营养品质与功能特性均得到明显改善。

在微生物的蛋白酶作用下，豆渣蛋白降解为肽，肽进一步降解为氨基酸，提高了其营养品质和生物利用率[19]。谢婧[20]以毛霉发酵豆渣，检测发酵前、后5 h 内豆渣营养成分的含量变化，结果表明豆渣中蛋白质降解率最高为11.17%，游离氨基酸上升率为8.8%；Kroenberg 等[21]以雅致放射毛霉发酵豆渣，在15 ℃发酵80 h 后，发现有酸性蛋白酶产生，还释放出大量氨基酸，非蛋白氮是发酵前的8 倍；Matsuo[22]分别用少孢根霉和米曲霉发酵豆渣，发现游离氨基酸上升率高达39%。综合考虑蛋白质的降解率和必须氨基酸的增加量，FW-1 展示了突出的优势。在FW-1 发酵豆渣中，蛋白的转化效率最高，为12.2%，必需氨基酸上升率高达12.3%，有效地提高了豆渣的营养品质。

微生物发酵将脂肪转化为脂肪酸，能够有效提高营养品质和其生物利用率。研究发现，胡耀辉等[23]以米曲霉发酵豆渣，研究发酵过程中营养成分的变化规律，结果显示脂肪的降解率为33%；Matuso[22]用少孢根霉发酵豆渣，其脂肪降解率高达60%；申春莉等[24]以豆渣为原料，研究灵芝菌丝体固态发酵豆渣过程中营养物质的变化，发现发酵后脂肪的降解率为74%，脂肪酸增加了1.4 倍。综合考虑脂肪的降解率和不饱和脂肪酸的增加量，本研究中，FW-3 显示了突出的优势，其对脂肪降解率高达77.8%，脂肪酸增加了2.3 倍，其中不饱和脂肪酸含量增加高达2.5 倍，有效地增加了豆渣的营养品质。

微生物发酵可以修饰异黄酮构型，使其由糖苷型向高活性的苷元型转变，显著提高异黄酮的生理活性[25]。谢婧[26]对毛霉发酵豆渣过程中异黄酮含量进行测定，结果发现前发酵阶段总异黄酮含量变化最大，增加了约1.4 倍，苷元型异黄酮明显提高，有效得改变了异黄酮的构型。综合考虑糖苷型异黄酮的降解率和苷元型异黄酮的增加量，本研究中FW-3 对异黄酮代谢的转化效率最高，增加了10.2 倍。

上述有关豆渣发酵的研究，由于使用菌种及其培养条件的差异，没有绝对的可比性，然而也可以看出微生物对豆渣的发酵转化效率。未来对发酵菌种代谢机制的探索和酶系的挖掘，必将加速豆渣的高附加值转化。此外，豆渣的另一主要营养成分膳食纤维的深度研究，也是需要进一步关注。

4 结论

以实验室保藏的3 株菌（少孢根霉FW-1、白地霉FW-2、无接合孢子根霉FW-3）发酵豆渣，分别于48，72 h 和96 h 取样，以接菌前未发酵豆渣为对照，系统分析了豆渣中蛋白质、脂肪和异黄酮的代谢变化规律。结果表明：豆渣中蛋白质和脂肪含量在发酵过程中整体呈现下降趋势，氨基酸和脂肪酸含量整体呈现上升趋势。综合对豆渣蛋白的降解能力和必须氨基酸增量的评估结果，少孢根霉FW-1 体现了较为突出的优势，其对蛋白质和肽的降解率分别为12.2%和25.2%，必须氨基酸的上升率为12.3%；就豆渣脂肪的降解能力、不饱和脂肪酸的增加和异黄酮的修饰改性而言，无接合孢子根霉FW-3 显示了突出的优势，其对豆渣脂肪的降解率高达77.8%，脂肪酸增加了2.3 倍，其中不饱和脂肪酸含量增加高达2.5 倍，对异黄酮构型由糖苷型转化为苷元型的效率增加高达10.2 倍。可见，不同菌种对豆渣的营养物质和功能成分的转化能力体现了较为显著的差异，本研究对豆渣的靶向高附加值开发提供了理论依据。