Cry1Ba3蛋白对亚洲玉米螟杀虫活性测定及其与BBMVs的结合分析

尹凤翔，孙 凯，束长龙，宋福平，张 杰

(中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193)

Cry1Ba3蛋白对亚洲玉米螟杀虫活性测定及其与BBMVs的结合分析

尹凤翔，孙 凯，束长龙，宋福平，张 杰*

(中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193)

提取并纯化Cry1Ba3蛋白截短片段，用饲喂人工饲料的方法对亚洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)初孵幼虫进行生物活性测定。结果显示，Cry1Ba3截短片段对亚洲玉米螟有良好的杀虫活性(LC50=5.29 μg/g，95%置信限为3.96～7.10μg/g)。而纯化的Cry1Ac蛋白60ku的活性片段对亚洲玉米螟初孵幼虫的杀虫活性LC50为0.83μg/g。提取亚洲玉米螟5龄幼虫的BBMVs，用纯化的Cry1Ba3和Cry1Ac蛋白进行竞争结合试验，结果显示Cry1Ba3与Cry1Ac在亚洲玉米螟中肠的结合没有竞争作用，说明两种毒素在亚洲玉米螟BBMVs上可能存在不同的受体。

Cry1Ba3蛋白； Cry1Ac蛋白； 亚洲玉米螟； 竞争结合

亚洲玉米螟[Ostriniafurnacalis(Guenée)]主要为害玉米、高粱、谷子等作物，造成颗粒缺失甚至绝收。随着转基因技术的发展，目前国内外已经将包括cry1Ab、cry1Ac、cry1Ah、cry1Fa、cry1Ie等多种Bt杀虫基因转入玉米中[1-3]，对亚洲玉米螟和欧洲玉米螟[OstrinianubilalisHübner)]等鳞翅目害虫具有良好的防治效果[4-5]。截至2012年底，全球转基因玉米种植面积高达5 510万hm2，充分显示了巨大的经济和社会价值[6]。然而，大面积种植转Bt基因抗虫作物不可避免地引发害虫对其产生抗性[7-8]。与此同时，室内人工汰选结果显示，亚洲玉米螟对Cry1Ac、Cry1Ab蛋白也会产生抗性[9]。因此，为延缓害虫抗性的产生，发掘与已商业化应用的基因无交互抗性的新的Bt基因成为一项紧迫的任务。

cry1Ba3基因是由本实验室克隆的杀虫毒素基因，其编码的Cry1Ba3蛋白对鳞翅目害虫小菜蛾[Plutellaxylostella( Linnaeus)]、鞘翅目叶甲科害虫马铃薯甲虫[Leptinotarsadecemlineata(Say)]等均有良好毒杀活性，已用于工程菌构建[10]。目前已经确定Cry1Ba3对小菜蛾的最小活性区为第22位到第655位氨基酸[11]，蛋白结构域II上loop2(或者与loop1一起)对毒素蛋白的毒力影响较大，而loop3的改变对Cry1Ba蛋白的杀虫活性没有显著影响[12]。进一步发现Cry1Ba3蛋白对Cry1Ac抗性小菜蛾有良好的杀虫活性，说明这两种毒素蛋白在小菜蛾上并无交互抗性[13]。

Bt Cry蛋白与昆虫中肠刷状缘膜囊泡(brush border membrane vesicles，简称BBMVs)上受体结合是发挥杀虫作用的关键步骤[14]。近年来随着Cry蛋白杀虫机理研究不断深入，来自昆虫的新受体不断被发现，糖基化磷脂酰肌醇(即GPI)锚定的氨肽酶N(APN)、糖基化磷脂酰基醇锚定的碱性磷酸酶(ALP)和类钙黏蛋白(Cad)相继被证实是Cry毒素在昆虫体内主要的受体种类[15-17]。

在实验室前期工作的基础上，本研究测定了Cry1Ba3对亚洲玉米螟的杀虫活性；比较了Cry1Ba3蛋白与Cry1Ac蛋白在亚洲玉米螟BBMVs上的竞争结合作用，为Cry1Ba3蛋白商业化应用和杀虫机理研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

本研究中用到的菌株和质粒见表1。

表1菌株与质粒

Table1Strainsandplasmids

菌株和质粒Strainsandplasmids特征Characterization来源Source菌株StrainsEscherichiacoliBL21F-，ompT，hsdSB(r-Bm-B)，gal(λcⅠ857，ind1，Sam7，nin5，lacUV5-T7gene1)，dcm(DE3)本实验室InthislabHD73B．thuringiensissubsp．kurstaki，carryingcry1Acgene本实验室Inthislab质粒PlasmidspET⁃1Ba3⁃3HAmpR，7．3kb，containing1．9kbcry1Ba3gene本实验室Inthislab

1.2 主要试剂和仪器

蛋白High range marker 购自赛默飞公司，镍亲和层析柱填料(chelating sepharose fast flow)购自GE公司，生物素(N-hydroxysuccinimidobiotin，NHS-Biotin)、碱性磷酸酶标记的亲和素(avidin-alkaline phosphatase，AP-avidin)等购自Sigma公司，蛋白Prestained precision plus marker、蛋白定量试剂盒购自Bio-Rad公司，碱性磷酸酶底物显色试剂盒购自冰达公司。

Beckman高速离心机Avanti J-26xp；德国台式Eppendorf 离心机5415C；美国Bio-Rad公司Mini protein Ⅲ蛋白电泳仪；美国GE公司高效液相色谱系统AKTA avant 25。

1.3 供试昆虫

亚洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)初孵幼虫和5龄幼虫由北京绽诺斯特公司提供。

1.4 Cry1Ba3蛋白的表达与提取

将携带有cry1Ba3半长基因质粒pET-1Ba3-3H的大肠杆菌BL21接种于5 mL LB液体培养基[18]中，37 ℃、220r/min活化过夜；1%接种于300mL LB液体培养基中，37 ℃、220r/min培养至A600到0.5左右；加入IPTG至终浓度为1mmol/L，18 ℃、150r/min诱导16h。离心收集菌体，将菌体悬浮于20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中。超声破碎细胞10min(超声功率：80%，超声：5 s，暂停：5 s)，12 000r/min离心10min，收集上清，沉淀用20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液悬浮；用SDS-PAGE电泳分析蛋白提取情况。

1.5 Cry1Ba3蛋白的亲和层析纯化

取1mL镍亲和层析柱填料装入层析柱，用5倍柱体积的超纯水清洗层析柱；加入1倍柱体积的0.1mol/L NiSO4，用移液器吸打混匀，室温静置10min，再用5倍柱体积的超纯水洗柱子；加入5倍柱体积的平衡缓冲液(20mmol/L Tris-HCl pH 8.5，0.5 mol/L NaCl，20mmol/L咪唑)平衡柱子，将Cry1Ba3蛋白上清液上样，接流穿的液体；待样品上完后，用3×5倍柱体积的平衡缓冲液洗去杂蛋白；用1倍柱体积的洗脱缓冲液1(20mmol/L Tris-HCl pH 8.5，0.5 mol/L NaCl，200mmol/L咪唑)洗脱下目的蛋白并收集，重复4次；用5倍柱体积的洗脱缓冲液2(20mmol/L Tris-HCl pH 8.5，0.5 mol/L NaCl，1mol/L咪唑) 洗脱下杂蛋白；加入各种清洗缓冲液(2 mol/L NaCl，1mol/L NaOH，70%乙醇)进行清洗；加入再生缓冲液(0.5 mol/L NaCl，0.05 mol/L EDTA，0.5 mol/L NaCl)将层析柱再生；SDS-PAGE检测洗脱下来的蛋白样品。

1.6 Cry1Ba3蛋白的凝胶过滤纯化

用AKTA avant蛋白液相分析系统对经过亲和层析纯化得到的Cry1Ba3溶液进行缓冲液置换，将目的蛋白溶液以2 mL/min的流速通过Hitrap 脱盐层析柱，然后用磷酸缓冲液同样以2 mL/min的流速进行洗脱，分体积接样并SDS-PAGE检测。挑选高纯度的Cry1Ba3蛋白溶液通过Centriplus YM30浓缩管(MilliPore公司)进行浓缩。

1.7 Cry1Ac蛋白的提取、消化和纯化

Cry1Ac蛋白的提取参见Xue等[19]的方法。将Cry1Ac蛋白与胰蛋白酶以质量单位比10∶1混合后，37 ℃温育，设时间梯度(1、2、3、4、5 h)进行消化，SDS-PAGE检测消化结果。消化后Cry1Ac蛋白的纯化过程参见周子珊等[20]的方法。

1.8 亚洲玉米螟的生物活性测定

Cry1Ba3蛋白设置8个浓度，分别为：0.33、1.0、3.0、9.0、27.0、81.0和243.0μg/g；Cry1Ac蛋白设置8个浓度，分别为0.037、0.11、0.33、1.0、3.0、9.0和27.0μg/g。生物活性测定过程参考韩海亮等[9]的方法。7 d调查结果，用SPSS软件对亚洲玉米螟生测结果统计分析。

1.9 Cry杀虫蛋白的生物素标记

称取2.2 mg Sulfo-NHS-SS-Biotin溶于360μL超纯水中，配制成10mmol/L溶液，向待标记蛋白溶液中加入20倍摩尔量的生物素溶液，室温静置4 h，离心除去过量的生物素。Western blotting杂交检测标记效果，并用碱性磷酸酶AP系统显色，操作见试剂盒说明书。

1.10 亚洲玉米螟中肠BBMVs的提取及定量

亚洲玉米螟5龄幼虫BBMVs的提取方法参考Wolfersberger方法[21]，然后用Bradford法(Bio-Rad试剂盒)对BBMVs进行总蛋白定量，操作见试剂盒说明书。

1.11 毒素蛋白与亚洲玉米螟BBMVs体外结合试验

在BBMV中加入适量标记好的毒蛋白，用含0.1% BSA的PBS补足至100μL，室温反应1h。18 000r/min离心10min后，用500μL含0.1% BSA的PBS缓冲液洗涤2次。加入10μL 1×SDS上样缓冲液后煮沸5 min，12 000r/min离心5 min，吸取上清，进行SDS-PAGE。采用Bio-rad装置，湿转法转移到PVDF膜上，膜在TBST中漂洗后置于封闭液中。缓慢摇动，室温封闭1h。之后弃封闭液，加入用PBS稀释的AP-Avidin，室温轻摇1h。用TBST浸洗PVDF膜3次，每次15 min。最后用NBT/BCIP试剂显色。竞争结合试验与结合的步骤大致相同，只是在加入标记蛋白的同时加入不同种类的过量未标记的毒蛋白，同样经过室温温育1h，最终通过Western blotting杂交检测其对标记蛋白结合的影响。

2 结果与分析

2.1 Cry1Ba3蛋白提取与纯化

用超声破碎法从大肠杆菌BL21菌株中提取Cry1Ba3蛋白。经DNAMAN软件分析可知，截短的Cry1Ba3蛋白分子量约为71ku。 经过镍亲和层析、透析并离心浓缩后最终得到Cry1Ba3蛋白的纯化结果，见图1。

图1 SDS-PAGE分析纯化的Cry1Ba3蛋白Fig.1 Analysis of purified Cry1Ba3protein by SDS-PAGE

2.2 Cry1Ac蛋白的提取、活化与纯化

用等电点沉淀法从HD73菌株中提取Cry1Ac蛋白，表达出的Cry1Ac蛋白大小约为130ku，经胰蛋白酶消化1h后，形成约60ku的活性片段。然后将样品通过AKTA avant蛋白液相分析系统进行阴离子交换层析、脱盐柱层析并离心浓缩，最终得到纯化的Cry1Ac蛋白(图略)。

2.3 纯化蛋白对亚洲玉米螟生物活性测定结果

经纯化的Cry1Ba3半长蛋白对亚洲玉米螟的LC50=5.29 μg/g，95%置信限为3.96～7.10μg/g；Cry1Ac活化蛋白对亚洲玉米螟的LC50=0.83μg/g，95%置信限为0.66～1.07 μg/g。

2.4 亚洲玉米螟BBMVs的提取和定量

从约2 500头亚洲玉米螟5龄幼虫解剖获得约10g中肠，分装后冻存于-70℃冰箱。提取BBMVs经过SDS-PAGE分析，条带清晰，分布均匀，能满足竞争结合试验要求(电泳图略)。 Bradford法(Bio-Rad试剂盒)对BBMVs总蛋白定量，最终计算得BBMVs浓度为7.65 mg/mL。

2.5 结合试验

首先用生物素标记的Cry1Ac蛋白与亚洲玉米螟的BBMVs进行体外饱和结合试验，Western blotting检测杂交结果见图2。结果显示Cry1Ac可以与亚洲玉米螟的BBMVs结合。终浓度为153μg/mL的亚洲玉米螟BBMVs与不同浓度的NHS-Biotin-Cry1Ac蛋白结合，发现从2.0μg/mL毒素蛋白浓度开始，随着蛋白浓度的逐渐增加，毒素与BBMVs结合量逐渐增加。当NHS-Biotin-Cry1Ac蛋白浓度为32.0μg/mL时，与BBMV的结合量达到饱和。

图2 BBMVs与NHS-Biotin-Cry1Ac结合的饱和度测定Fig.2 Determination of saturated binding between NHS-Biotin-Cry1Ac toxin and BBMVs

向亚洲玉米螟BBMVs与Cry1Ac蛋白饱和结合的反应体系中，分别加入5倍、10倍、100倍过量的未标记的Cry1Ba3蛋白，进行竞争结合试验，用Western blotting检测结果，见图3。当加入不同量未标记的Cry1Ba3蛋白进行异源竞争时，经配体杂交荧光检测显示：标记的Cry1Ac蛋白条带的亮度没有发生变化，即说明对标记的Cry1Ac蛋白与亚洲玉米螟BBMVs的结合没有影响(样品2～4)，异源竞争没有发生；而加入等量未标记的Cry1Ac蛋白进行同源竞争时，配体杂交荧光检测显示Cry1Ac蛋白条带的亮度变暗(样品1)，即说明标记的Cry1Ac蛋白与亚洲玉米螟BBMVs的结合作用减弱，发生了同源竞争作用。

同样，用生物素标记的Cry1Ba3蛋白对亚洲玉米螟BBMVs进行饱和结合试验，结果见图4。终浓度为153μg/mL的亚洲玉米螟BBMVs与不同浓度的NHS-Biotin-Cry1Ba3蛋白结合，发现从0.5 μg/mL毒素蛋白浓度开始，随着蛋白浓度的逐渐增加，毒素与BBMVs结合量逐渐增加。当Cry1Ba3蛋白浓度为8.0μg/mL时，与BBMVs的结合量达到饱和。

图3 对Cry1Ac与BBMVs结合的同源及异源竞争Fig.3 Homologous and heterologous competition for NHS-Biotin-Cry1Ac binding to BBMVs

图4 BBMVs与NHS-Biotin-Cry1Ba3结合的饱和度测定Fig.4 Determination of saturated binding between NHS-Biotin-Cry1Ba3toxin and BBMVs

向亚洲玉米螟BBMVs与标记Cry1Ba3蛋白饱和结合的反应体系中，分别加入100倍、300倍过量的未标记Cry1Ac蛋白和10倍、100倍未标记的Cry1Ba3蛋白，进行竞争结合试验，Western blotting检测结果见图5。当加入不同量未标记的Cry1Ac蛋白进行异源竞争时，经配体杂交荧光检测显示标记的Cry1Ba3蛋白条带的亮度没有发生变化，即说明未发生异源竞争作用(样品2和3)，而加入10倍浓度未标记的Cry1Ba3蛋白进行同源竞争时，标记的 Cry1Ba3蛋白仅有很弱的条带(样品4)，加入100倍浓度未标记的Cry1Ba3时标记蛋白与BBMVs的结合被完全竞争(样品5)，发生了同源竞争作用。

图5 对Cry1Ba3与BBMVs结合的同源及异源竞争Fig.5 Homologous and heterologous competition for NHS-Biotin-Cry1Ba3binding to BBMVs

3 讨论

本研究提取并纯化了Cry1Ba3蛋白，对亚洲玉米螟进行生物活性测定，结果显示截短的Cry1Ba3蛋白对亚洲玉米螟具有良好的杀虫活性，高于Cry1Ba3全长蛋白(数据未显示)。本研究中使用的Cry1Ba3蛋白是Cry1Ba3的71ku的N端活性区，包括第22位至655位氨基酸，昆虫摄入体内以后可能会进一步消化成为真正的活性片段。

本研究证明Cry1Ba3与Cry1Ac蛋白在亚洲玉米螟的BBMVs上没有竞争作用，表明两种毒素蛋白在亚洲玉米螟BBMV上可能存在不同的受体。毒素与受体的结合在其发挥杀虫活性的过程中有关键的作用，也是昆虫产生抗性的重要环节[22]。Sek Yee Tan等通过比较Cry1Ab和Cry1Fa与亚洲玉米螟和欧洲玉米螟BBMV的结合作用，发现Cry1Ab或Cry1Fa分别在这两类玉米螟体内有相似的受体，而在亚洲玉米螟或者欧洲玉米螟体内这两种Cry蛋白各自的高亲和力受体并不相同，这也支持了之前报道的Cry1Ab和Cry1Fa在玉米螟上表现出低交互抗性的现象[23]。已经证明Cry1Ba3对Cry1Ac抗性小菜蛾有很好的杀虫活性，为了探究Cry1Ba3与Cry1Ac在亚洲玉米螟上是否存在交互抗性，接下来需要将Cry1Ba3对亚洲玉米螟的抗性品系进行生物活性测定。Cry1Ba3全长蛋白和Cry1Ac全长蛋白的氨基酸序列相似性为57%，结构域Ⅱ区域的相似性为28%。大量的研究证明结构域Ⅱ决定Cry毒素蛋白与昆虫受体的特异性结合[24]。所以今后可以选择结构域Ⅱ氨基酸序列相似性低的Cry毒素蛋白基因的组合作为综合防治虫害和研发转基因植物时的备选基因，有利于规避昆虫对Cry毒素蛋白产生交互抗性的风险。

Cry1Ba3和Cry1Ac蛋白的纯化是本试验的关键。提取的Cry1Ba3半长片段经过镍亲和层析纯化后溶液中咪唑浓度很高，影响后续生物素标记试验和竞争结合试验的效果，需要通过透析的方法除去。用胰蛋白酶对Cry1Ac蛋白消化以后，溶液中有大量酶解下的小肽段，也会影响后续试验，所以需要对Cry1Ac进行缓冲液置换。为得到纯度较高的样品，在用AKTA avant蛋白液相分析系统进行纯化时，色谱图出峰后要小体积收集样品，避免交叉污染。

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AnalysisofinsecticidalactivityofCry1Ba3proteinagainstOstriniafurnacalisandbindingassaywithBBMVs

Yin Fengxiang, Sun Kai, Shu Changlong, Song Fuping, Zhang Jie

(StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

Truncated fragment of Cry1Ba3protein was extracted and purified.Bioassay against neonates ofOstriniafurnacaliswas conducted by feeding artificial diet with the truncated fragment of Cry1Ba3.The result showed truncated fragment of Cry1Ba3had a high toxicity againstO.furnacalis(LC50=5.29 μg/g，95% fiducial limit was between 3.96and 7.10μg/g).LC50of purified active fragment of Cry1Ac protein,with molecular weight of 60ku,was 0.83μg/g against neonates ofO.furnacalis.Then the BBMVs of the fifth instar larvae ofO.furnacaliswas extracted.Competitive binding experiment was conducted by using purified Cry1Ba3and Cry1Ac protein.The result showed Cry1Ba3and Cry1Ac had no competitive action in the process of binding to midgut ofO.furnacalis,indicating these two toxins may have different receptors on BBMVs ofO.furnacalis.

Cry1Ba3protein; Cry1Ac protein;Ostriniafurnacalis; competitive binding

2013-06-08

：2013-10-20

国家“973”计划项目(2009CB118902)；国家自然科学基金项目(31272115)

S 476.12

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.02.005

* 通信作者 Tel: 010-62815921； E-mail: jzhang@ippcaas.cn