高效好氧反硝化菌筛选及复合菌群脱氮特性研究*

杜 颜，李思盈，韩世博，艾云鹤

（东北农业大学 资环学院，黑龙江 哈尔滨 150038）

传统生物脱氮技术主要分硝化、反硝化两个处理阶段，硝化阶段好氧，反硝化阶段则被认为是严格的厌氧阶段。直到20世纪70年代，J.M.Krul等人才首次证明了好氧反硝化反应现象的存在。

因好氧反硝化可以在有氧条件下进行反硝化，故在脱氮工艺中可省去缺氧池，从而减少构筑物，缩小占地空间，降低建设成本；其次，反硝化过程中会产生一定的碱度，可以与硝化过程中产生的酸中和，无需另外向反应池中投加碱，节省了直接成本；再次好氧反硝化菌的繁殖周期短，反应速度快，节省反应步骤，缩短了反应时间，减少了含氮化合物的逸出，为实际生产中的脱氮工艺拓展了思路，具有很好的应用价值及广阔的应用前景[1-3]。

本研究从活性污泥中筛选出了6株好氧反硝化细菌，对此6株菌进行了单株菌的反硝化性能研究，并将其中对各种环境适用性好的3株菌进行混合，进行了混合菌群的反硝化效果实验，以期为好氧反硝化研究提供一定的帮助。

1 实验部分

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 菌株来源

冬季从东北农业大学生活污水处理厂取污水处理反应器中的活性污泥若干，经过驯化和筛选，得到好氧反硝化菌6株。

1.1.2 主要试剂及仪器

乙二胺二乙酸二钠（哈尔滨市化工试剂厂）；ZnSO4（天津市瑞金特有限公司）；CaCl2（天津市致远化学试剂有限公司）；FeSO4（天津市恒星化学试剂有限公司）；CoCl2（天津市化学试剂三厂）。以上试剂均为分析纯。

T6型紫外可见分光光度计（普析仪器科技有限公司）；SPX-150B型生化培养箱（上海博迅设备厂）；BXM-30R型立式压力蒸汽灭菌锅（上海博迅设备厂）。

1.1.3 培养基

LB培养基KNO31g、KH2PO41g，FeCl20.5g，CaCl20.02g，MgSO41g，琥珀酸钠8.5g，用蒸馏水稀释至1L。

BTB培养基 丁二酸钠8.5 g，KNO31g，KH2PO41g，CaCl20.2g，MgSO41g，FeCl20.5g，1%溴百里酚蓝溶液1mL，琼脂20g，定容至1L，调节pH值至7.2。

乙酸钠培养基 乙酸钠2.16g，NaNO30.61g，K2HPO41.76g，MgSO40.20g，CaCl20.02g，FeSO40.005g，琼脂18g，用蒸馏水稀释至1L，调节pH值为7.2。

柠檬酸钠培养基 柠檬酸钠1.0g，KNO31.0g，KH2PO41.0g，FeSO4·7H2O 0.05g，CaCl20.2g，MgSO41.0g，琼脂18g，1%溴百里香酚蓝1mL，用蒸馏水稀释至1L，调节pH值为6.8。

1.1.4 其它试剂

微量元素溶液 乙二胺四乙酸50.0g（AR哈尔滨 市 化 工 试 剂 厂），ZnSO42.2g，CaCl25.5g，MnCl25.06g，FeSO45.0g，CuSO41.57g，CoCl21.01g。

模拟废 水水样 葡 萄 糖0.206g，（NH4）2SO40.235g，K2HPO40.1g，Na2HPO40.1g·L-1，MgSO40.1g，微量元素溶液1mL·L-1，1% Fe（NH4）2·（SO4）2·6H2O溶液1mL。

1.2 实验方法

1.2.1 好氧反硝化菌的筛选

菌液的富集 取50mL活性污泥放于无菌三角瓶中，加入450mL的LB培养基，室温下曝气8h，转入培养箱30℃、150r·min-1培养8h，再室温下曝气8h后，放置30min，取上清液进行筛选实验。

好氧反硝化菌株的初筛 取富集好的菌液上清液1mL，稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，将稀释好的菌液各取1mL接种于BTB培养基上，培养1d后，挑取培养基周围变为蓝色且生长情况良好的菌落，划线接种于柠檬酸钠培养基上，继续培养1d，以相同方法挑取生长情况良好的菌落接种于乙酸钠培养基继续纯化培养1d，选取生长情况良好的菌落作为目的菌[4]。

好氧反硝化菌株的复筛 挑取目的菌加入无菌水，制成菌悬液，紫外分光光度计测定OD600，加入模拟废水水样、微量元素溶液，30℃培养1d，测定NO3-N去除率。

1.2.2 菌株的观察及简单鉴定 将分离、纯化好的菌株接种于柠檬酸钠培养基上，24h后观察其个体形态、菌落形态，并进行革兰式染色鉴定。

1.2.3 菌株的脱氮特性研究 采用固定单因素法研究碳源、C/N比、pH值、接种量、温度等影响因素对好氧反硝化作用的影响。

1.2.4 好氧反硝化菌群的脱氮性能研究 将筛选出来的6株菌等比例混合，在单菌株确定的最佳工艺条件下，测定其脱氮性能。

式中C1：反应前NO3-N的含量，mg·L-1；C2：反应后NO3-N的含量，mg·L-1。

1.2.5 分析鉴定方法 本实验中硝酸盐-采用水质硝酸盐氮的测定紫外分光光度法（HJ/T 346-2007）进行测定。

2 结果与讨论

2.1 好氧反硝化菌的筛选结果

经过好氧反硝化菌的富集筛选、分离纯化，最终得到去除NO3-N效果良好的6株菌，分别命名为DN-1、DN-2、DN-3、DN-4、DN-5、DN-6，菌落特征见表1。

表1 细菌分离筛选结果Tab.1 Results of bacterial isolation and screening

由表1可见，筛选出的优势菌均为革兰氏阴氏菌，其中5株菌为短杆菌，1株菌为球菌。

2.2 菌株的脱氮特性研究

2.2.1 不同碳源对NO3-N去除率的影响 为保证好氧反硝化菌的正常生长及脱氮作用的正常进行，在反应过程中需要提供一定的碳源，因此，最佳碳源和C/N比的选择对反应尤为重要。本研究分别选择了乙酸钠、葡萄糖、柠檬酸钠3种有机物为碳源，以5%的接种量，在反应温度30℃，150r·min-1下培养48h，考察了不同碳源对NO3-N去除率的影响，结果见图1。

图1 不同碳源对NO3-N去除率的影响Fig.1 Influence of different carbon sources for nitrate-N removal rate

由图1可知，不同碳源下DN-1、DN-2、DN-5这3株菌的NO3-N去除率由低到高的顺序是乙酸钠＜葡萄糖＜柠檬酸钠，DN-3、DN-4两株菌的NO3-N去除率由低到高的顺序是乙酸钠＜柠檬酸钠＜葡萄糖，DN-6的NO3-N去除率由低到高的顺序是葡萄糖＜柠檬酸钠＜乙酸钠，其中DN-1、DN-2、DN-3 3株菌当柠檬酸钠为唯一碳源时的去除效果更加明显，而DN-3、DN-4、DN-6这3株菌虽然柠檬酸钠为碳源时去除率不是最大的，但也只是略低于其去除率最高的碳源。在6株菌中只有DN-6对3种碳源都有很好的利用率，而其它5株菌对乙酸钠的利用率均不高。综合以上原因，后续实验中均以柠檬酸钠为唯一碳源进行测定。

2.2.2 不同C/N比对NO3-N去除率的影响 选择柠檬酸钠为唯一碳源，以5%的接种量，反应温度30℃，150r·min-1下培养48h，考察了C/N比为4∶1、8∶1、12∶1、16∶1、20∶1时，NO3-N去除率的情况，结果见图2。

图2 不同C/N比对NO3-N去除率的影响Fig.2 Effect of different C/N ratio on NO3-N removal rate

由图2可见，DN-1、DN-3、DN-4、DN-6这4株菌NO3-N去除率的变化趋势均是随着C/N比的增加，去除率逐渐升高而后下降，这4株菌的最佳C/N比分别为8∶1、12∶1、8∶1、8∶1，DN-2菌株对NO3-N去除率随着C/N比的增加而上升，C/N比为16∶1和20∶1去除效果比较接近，C/N比为20∶1时去除率最高，而DN-5菌株对NO3-N去除率随着C/N比的增加而下降，去除效果最好的是C/N比为4∶1，即该种菌的C/N比最低。在好氧反硝化反应过程中，C/N比过低，能源不足，提供的电子流小，影响了菌体生长，降低了反硝化效果，但C/N比过高，不仅资源浪费，而且过高的C/N比还会影响反硝化的效果[5]，故C/N比过低或过高均不适合脱氮效率的提高，综合考虑以上因素，将本实验的C/N比定为8∶1。

2.2.3 不同pH值对NO3-N去除率的影响 选择柠檬酸钠为唯一碳源，C/N比为8∶1，以5%的接种量，反应温度30℃，150r·min-1下培养48h，考察了pH值为5、6、7、8、9时，NO3-N去除率的情况，结果见图3。

图3 不同pH值对NO3-N去除率的影响Fig.3 Effect of different pH ratio on NO3-N removal rate

由图3可见，DN-1、DN-2、DN-3、DN-4、DN-6这5株菌NO3-N去除率的变化趋势均是随着pH值的增加，去除率逐渐升高而后略有下降，DN-1、DN-2、DN-3、DN-4这4株菌的最佳pH值为8，DN-6在pH值为7时去除率最高，为98.6%，DN-5的情况较为特殊，随着pH值的增加，去除率一直增加，在pH值为8和9时，去除率相同，均为95.6%。在此6株菌中，DN-3、DN-6两株菌的pH值适用范围最宽，在pH值为5时，去除率可达到86%以上，在pH值为9时，去除率更是达到95.6%以上。总体来说，这6株菌均在pH值为7～9处有最佳去除率。酸度过高或者过低不利于大多数菌的生长，这主要是因为pH值变化时，影响了微生物中酶的活性，改变了微生物的电解质平衡，从而影响微生物对营养物质的摄取能力，故不利于其生长[6]。此结果也说明，筛选出的好氧反硝化菌在中性偏弱碱性的环境中更易去除NO3-N。综合考虑以上因素，将本实验的最佳pH值定为8。

2.2.4 不同温度对NO3-N去除率的影响 选择柠檬酸钠为唯一碳源，C/N比为8∶1，以5%的接种量，pH值为8，150r·min-1下培养48h，考察了反应温度为15、20、30℃时，NO3-N去除率的情况，结果见图4。

图4 不同温度对NO3-N去除率的影响Fig.4 Effect of different temperatures on NO3-N removal rate

由图4可知，6株菌NO3-N去除率的变化趋势均是随着温度的增加逐渐升高，当温度由15℃升高到30℃时，DN-4和DN-5两株菌的NO3-N去除率受温度影响变化比较大，去除率分别增加了10.97%和11.31%，而DN-2和DN-6两株菌的NO3-N去除率受温度影响比较小，当温度由15℃升高到30℃时，去除率分别增加了2.09%和2.79%。结果表明，升高温度对于NO3-N的去除有一定的效果，但相对来说，筛选出的菌株在15～30℃，均能保持比较高的活性，这与取样的季节为冬季，水体温度较低，菌株已受到一定的自然驯化不无关系。

2.2.5 不同接种量对NO3-N去除率的影响 选择柠檬酸钠为唯一碳源，C/N比为8∶1，温度为30℃，pH值为8，150r·min-1下培养48h，考察了接种量为2%、5%、7%和10%时，NO3-N去除率的情况，结果见图5。

由图5可见，DN-1、DN-2、DN-3、DN-4、DN-6这5株菌NO3-N去除率的变化趋势均是随着接种量的增加，去除率逐渐升高而后略有下降，其最佳接种量分别为7%、5%、7%、5%、7%，只有DN-2在2%处即达到最大去除率97.37%，继续增加接种量，其去除率反而下降。出现上述情况的原因是，如果在反应过程中接种量不足，菌的数量少，会达不到脱氮的预期效果；而接种量过大，则会引起竞争现象，营养物质不足，使部分细菌死亡[7]。所以，选择适量的接种量，对于脱氮的效果很关键。考虑到在接种量为2%时，6株菌的去除率均已达到93%以上，故工艺最佳接种量定为2%。

图5 不同接种量对NO3-N去除率的影响Fig.5 Effect of different inoculation amount on NO3-N removal rate

2.2.6 好氧反硝化菌群的脱氮特性研究 依据上述实验研究结果，选择各种碳源利用高并且温度、pH值适用范围广的DN-6，C/N比需求最低的DN-5，和在最小接种量下NO3-N去除率仍可达97.4%的DN-2，以相同比例将3株菌混合组成好氧反硝化菌群，选择柠檬酸钠为唯一碳源，C/N比为4∶1，温度为30℃，pH值为8，接种量为2%，150r·min-1下培养48h后，进行NO3-N去除率的情况研究，复合菌与单株菌的NO3-N去除率的对比见图6。

由图6可知，复合菌群的NO3-N的去除率达98.6%，好于任何一株单株菌。主要的原因是在混合菌群中，各种菌的共存和相互作用产生了群体感应、互利共生等作用，使混合菌的脱氮能力有了一定程度的提高。另外，在实际水处理过程中，水质成分一般比较复杂，单株菌的降解能力有限，利用菌群中各种菌的协同作用，会对脱氮性能有很大的提高[8-11]。

3 结论

本研究筛选分离得到了6株好氧反硝化细菌，并选择其中适用性好的3株菌组成复合菌群，结论如下：

（1）筛选得到的6株菌均在柠檬酸钠为碳源的情况下有较好的脱氮效果，DN-6对3种碳源都有很好的利用率。

（2）C/N比为8∶1时，6株菌的脱氮效果综合考虑比较理想。

（3）温度高对于脱氮有利，相对来说，6菌株适用的温度范围比较大。

（4）将筛选出的3株菌制成复合菌群，效果明显好于单株菌。

实验表明，选择好氧反硝化菌群更有利于脱氮效果的提高，在实际应用中，由于其适应能力更强，将具有更好的应用价值。