豇豆轮纹病病菌产毒条件筛选及毒素活性测定

刘志恒，李健冰，安 心，李 蔚，曹友文，王君赫

(1.沈阳农业大学植物保护学院，沈阳 110866； 2.彰武县植保站，阜新 123200)

豇豆轮纹病病菌产毒条件筛选及毒素活性测定

刘志恒1*，李健冰1，安 心1，李 蔚1，曹友文2，王君赫1

(1.沈阳农业大学植物保护学院，沈阳 110866； 2.彰武县植保站，阜新 123200)

采用种子萌发抑制率和种子胚芽抑制率的检测方法，研究了豇豆轮纹病病原菌(Corynesporacassiicola)在不同培养基、培养时间、培养温度、培养液pH、光照和振荡条件下粗毒素的产生及其活性。试验结果表明：不同的培养条件下病原菌产生毒素活性不同，查彼培养液为最佳培养液，振荡培养可以促进毒素的产生，最适的产毒pH为7～8，最适温度为20～25 ℃，最佳培养时间为15 d，光照条件下病原菌粗毒素的活性最大。豇豆轮纹病粗毒素对于不同寄主的活性测定结果表明：豇豆轮纹病菌毒素接种的10种供试植物中，大豆、菜豆致病反应明显，相对的病斑较大，而对黄瓜无致病力，不产生病斑。

豇豆轮纹病； 多主棒孢菌； 毒素； 活性

豇豆作为辽宁的主要蔬菜作物之一，随着栽培面积的扩大和栽培年限的增加，病害的种类和病原菌的种群结构发生了很大变化，出现了一些新病害。2011年8月作者在辽宁省新民市调查中发现一种新病害，该病害主要危害豇豆叶片，严重时也危害豆荚，病害蔓延迅速并且危害严重，在7-8月危害最重，病叶率达到60%以上，给豇豆生产造成了很大损失。作者通过病害症状描述、病原菌形态鉴定及分子序列比对，并经柯赫氏法则证病，证明豇豆上新见病害——轮纹病的病原菌为真菌多主棒孢(Corynesporacassiicola)。

长期以来，种植抗病品种和施用化学农药在防治真菌病害中发挥了巨大作用，但由于多数病原真菌容易发生遗传变异，因此，出现抗性菌株的现象经常发生，并且高剂量的施用化学农药势必会影响环境及食品的安全性。病菌致病粗毒素在适当的选择剂量下可用于筛选高抗病水平的突变体[1]，病原菌的产毒能力与培养基类型和环境条件密切相关[2]。为了明确毒素在病程中的作用和应用粗毒素进行细胞突变体筛选，首先需要培养出大量的病菌粗毒素。然而对于豇豆轮纹病病原菌的毒素培养条件迄今未见报道。

本研究在分离豇豆轮纹病的基础上，初步探讨了豇豆轮纹病菌的产毒培养条件,以期为豇豆轮纹病的相关研究提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试作物选用9种：豇豆、菜豆、大豆、花生、茄子、辣椒、丝瓜、黄瓜和西葫芦。采用市售幼苗用于试验。

1.2 病原菌分离及毒素的提取

2011-2012年，于辽宁省新民市露地栽培豇豆采集具有典型特征的轮纹病叶片，采用常规组织分离方法[3]进行病原菌分离和纯化，并经单孢分离获得病菌纯培养备用。

采用常规方法培养获取病菌毒素。将供试菌株于PDA平板培养基恒温培养，用打孔器打取约0.5 cm的菌饼4块，置于下述供试液体培养基内培养。将不同条件培养获得的病菌培养液用8层无菌纱布过滤，然后滤液用滤纸抽滤，得到无菌滤液。将无菌滤液经8 000r/min离心10min，取得上清液即为病原菌粗毒素[4]。将所得的粗毒素接种于供试豇豆种子上，置于25 ℃黑暗条件培养36h，计测种子萌发率及胚芽长度。

1.3 试验方法

1.3.1 病原菌粗毒素产生条件的筛选

培养液的筛选。试验选用以下5种培养基，调节pH均为7。

(1)PD培养液：马铃薯200g，葡萄糖12 g，蒸馏水1000mL。

(2)PS培养液：马铃薯200g，蔗糖12 g，蒸馏水1000mL。

(3)Fries培养液：酒石酸铵5 g，KH2PO41.0g，NH4NO31.0g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.1g，CaCl20.1g，酵母浸膏 1.0g，蔗糖30g，蒸馏水1000mL。

(4)Czapek培养液：NaNO32 g，K2HPO41g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO40.01g，蔗糖 30g，蒸馏水 1000mL。

(5)Richard培养液：KNO310g，KH2PO45 g，MgSO4·7H2O 2.5 g，FeCl30.02 g，蔗糖 50g，蒸馏水1000mL。

培养时间筛选。设置3、6、9、12、15、18、21、24 d计8个处理时间。将直径0.5 cm菌饼移入Fries培养液(前述预备试验后选定)三角瓶中，于25 ℃、黑暗条件、120r/min培养箱中振荡培养。分别于不同时间取样制备豇豆轮纹病病菌粗毒素。试验设3次重复。

培养pH筛选。设置pH分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0共8个梯度处理。将直径0.5 cm菌饼移入Fries培养液三角瓶中，培养温度25 ℃，15 d后取样制备豇豆轮纹病病菌粗毒素。试验设3次重复。

培养温度筛选。设置温度为5、10、15、20、25、30、35 ℃计7个培养温度处理。将直径为0.5 cm菌饼移入Fries培养液三角瓶中分别培养，15 d后取样制备豇豆轮纹病病菌粗毒素。试验设3次重复。

培养光照条件筛选。选择3种条件：24 h光照、24 h黑暗、12 h光照和12 h黑暗交替。将直径0.5 cm菌饼移入Fries培养液中，于25 ℃、120r/min培养箱中振荡培养。15 d后取样制备豇豆轮纹病病菌粗毒素。试验重复3次。

振荡条件筛选。设置24 h振荡、24 h静置、12 h静置12 h振荡3种条件。将直径0.5 cm菌饼移入Fries培养液三角瓶中，25 ℃、黑暗、120r/min培养箱中培养。15 d后取样制备豇豆轮纹病病菌粗毒素。试验重复3次。

1.3.2 病原菌粗毒素活性的测定

叶片测定法。豇豆植株上的健康叶片用无菌水洗净，采用针刺法将蘸有1mL粗毒素的脱脂棉放入伤口上，25 ℃光照保湿培养，3d后观察叶片处理部位的病变情况。以空白培养液为对照。

幼苗浸渍法。取大约8 cm株高的豇豆幼苗，放入装有5 mL豇豆轮纹病粗毒素的试管内培养，观察幼苗生长情况，以空白培养液为对照。

不同植物敏感性测定。播种茄子、番茄、花生、大豆等作物，待作物4～6片叶时，采用针刺法,以蘸有豇豆轮纹病病菌粗毒素的脱脂棉接种供试植株叶片上，保湿培养观察叶片针刺部位发病情况，测量病斑直径大小。以空白培养液为对照。

1.3.3 粗毒素的生物活性测定

取粗毒液5 mL注入培养皿中作为种子萌发培养液，每皿放入20粒豇豆种子。重复5次。置于25 ℃黑暗条件下培养36h，计测豇豆种子萌发数及胚芽长度，计算萌发率和胚芽抑制率。

胚芽生长抑制率(%) =

1.3.4 数据统计与分析

每个处理重复5次，所得数据用SPSS和Excel软件分析。

2 结果与分析

2.1 不同条件对病原菌毒素产生的影响

不同的培养基病原菌毒素的产生量不同，在查彼培养液中的产生量最大，种子萌发抑制率及胚芽抑制率均达到80%以上，其次为Fries培养液，产生粗毒素最少的为PD培养液(表1)。

表1病菌在不同培养液产生的粗毒素对豇豆种子萌发和胚芽生长抑制率的影响1)

Table1Effectofcrudetoxinunderdifferentculturemediaontheinhibitoryrateofcowpeaseedgerminationandgermgrowth

培养液Culturemedia种子萌发抑制率/%Inhibitionrateofseedgermination胚芽生长抑制率/%Inhibitionrateofgermgrowth PD28．89e18．95f PS41．11d35．73e Rich45．56d54．57d Fries70．00c70．66c Czapek83．33b81．18b CK98．00a98．00a

1) 根据Duncan分析，同列数据后相同小写字母表示数据间无显著性差异(P=0.05)。 Within the same column,the means with the same lowercase letters indicate no significant difference atP=0.05 according to Duncan’s analysis of variance.

不同培养时间对病原菌粗毒素的影响见图1。在培养3～15 d之间，随着时间的延长，种子萌发、胚芽生长抑制率逐渐变大并且从图中可知曲线的斜率较大，因此毒素的产生与培养时间具有一定的正相关。在15 d时无论种子萌发抑制率还是胚芽生长抑制率均达到80%以上；在15～21d时，病原菌粗毒素随着时间的延长种子萌发及胚芽生长抑制率均下降。据此认为，病原菌产毒的最佳培养时间为15 d。

不同pH对病原菌粗毒素的影响根据图2结果可知，豇豆轮纹病病原菌在pH 2～9之间均可产生毒素。在pH 2～8间，病原菌粗毒素的产生量随pH值的增加而增加。在pH 8时，抑制率最大，种子萌发抑制率71.35%，胚芽生长抑制率72.68%。当pH为9时，抑制率下降为50%以下。据此确定病原菌产毒最佳pH为 8。

图1 病菌在不同时间产生的粗毒素对豇豆种子萌发和胚芽生长抑制率的影响Fig.1 Effect of crude toxin under different culture time on the inhibition rate of cowpea seed germination and germ growth

图2 病菌在不同pH产生的粗毒素对豇豆种子萌发和胚芽生长抑制率的影响Fig.2 Effect of crude toxin under different pH values on the inhibition rate of cowpea seed germination and germ growth

不同温度对病原菌粗毒素的影响见图3。由图3可知，病原菌粗毒素在5～35 ℃之间均可产生，对种子萌发及胚芽的抑制率随着温度的升高逐渐增高。在25 ℃时种子萌发抑制率达到最大为72.22%，胚芽生长抑制率为62.33%；而其后随着温度的升高抑制率逐渐降低，在35 ℃时种子萌发抑制率仅为28.89%，胚芽生长抑制率为38.36%。由此可知，豇豆轮纹病菌粗毒素在25 ℃时产生量最大。

不同光照对病原菌粗毒素的影响见图4。由图4可知，光照条件下种子萌发抑制率达63.33%，胚芽生长抑制率为65.75%；而黑暗条件下种子萌发抑制率为48.89%，胚芽生长抑制率为49.32%。表明光照条件有利于病原菌粗毒素的产生。

图3 病菌在不同温度条件下产生的粗毒素对豇豆种子萌发和胚芽生长抑制率的影响Fig.3 Effect of crude toxin under different temperatures on the inhibition rate of cowpea seed germination and germ growth

图4 病菌在不同光照条件下产生的粗毒素对豇豆种子萌发和胚芽生长抑制率的影响Fig.4 Effect of crude toxin under different light conditions on the inhibition rate of cowpea seed germination and germ growth

不同振荡条件对病原菌粗毒素的影响测定结果见图5。不同振荡条件对病原菌粗毒素的产生影响不同。间歇振荡利于病原菌粗毒素产生，种子萌发抑制率达74.44%，胚芽生长抑制率为70.55%；而静止培养下抑制率仅为40%。因此间歇振荡培养利于病原菌粗毒素产生。

2.2 病原菌毒素活性测定结果

针刺豇豆叶片接种粗毒素，3d后观察到叶片上可产生类似于真菌感染后产生的病斑，病斑中心成黄褐色枯斑，周围产生黄色晕圈，具明显的同心轮纹。表明病菌粗毒素对叶片细胞组织具有致病危害作用。试验结果为毒素在病程中是主要致病因子提供了佐证(图6)。

图5 病菌在不同振荡条件下产生的粗毒素对豇豆种子萌发及胚芽生长抑制率的影响Fig.5 Effect of crude toxin under different shaking conditions on the inhibitory rate of cowpea seed germination and germ growth

图6 针刺叶片接种毒素后的症状(24 h)Fig.6 Leaf symptoms after stab inoculation with the toxin(24 h)

幼苗浸渍致萎法测定表明，豇豆轮纹病病菌粗毒素可以对豇豆幼苗产生明显的毒害作用。毒素处理24 h后，豇豆幼苗开始脱水呈现青枯状，48 h后，用毒素处理的幼苗完全脱水萎蔫(图7)。

图7 毒素处理后萎蔫(2 d)Fig.7 Wilting after treatment with toxin(2 d)

不同寄主对粗毒素的敏感性测定结果表明(表2)，针刺接种3d后，10种供试植物中，豆科及茄科作物植株均产生不同程度的病斑，其中大豆、菜豆、茄子上的病斑较大，分别为2.0、1.2、1.5 cm；然而葫芦科作物中的黄瓜及西葫芦均未产生病斑，丝瓜病斑直径为1.2 cm；番茄、辣椒、花生病斑相对较小。

表2不同寄主上毒素致病反应测定1)

Table2Toxicitydeterminationofthecrudetoxinondifferenthostplants

寄主植物Hostplant病斑直径/cmDiameteroflesions寄主植物Hostplant病斑直径/cmDiameteroflesions番茄Tomato0．5e花生Peanut0．3f辣椒Pepper0．2f大豆Soybean2．0a茄子Eggplant1．5b西葫芦Squash0g 菜豆Bean1．0d黄瓜Cucumber0g 豇豆Cowpea1．2c丝瓜Suakwavegetablesponge1．2c

1) 不同小写字母表示0.05水平差异显著。 Different small letters indicated significant difference at 0.05 level.

3 讨论

植物病原菌毒素能使寄主产生特定症状反应，在植物病害发生、发展过程中具有明显致病或致毒作用，是一类重要的致病因子[5-6]。1975年Onesirosan等[7]最先报道了多主棒孢能产生毒性物质。1983年，Toder[8]研究表明：病菌致病粗毒素在适当的选择剂量下可用于筛选高抗病水平的突变体。然而培养基内毒素的产生量直接受培养基成分和外界环境条件的影响[9-10]。因此为了筛选出抗病突变体，病原菌粗毒素培养条件的筛选是其基础，但是在国内尚无报道豇豆轮纹病粗毒素培养条件的筛选。本研究结果表明：豇豆轮纹病产毒最适培养液为查彼培养液，光照有利于病原菌粗毒素的产生。病原菌在0～35 ℃之间均可产生毒素，在25 ℃时毒素的产量最高。在pH 8的条件下粗毒素产生最多，振荡可以促进病原菌粗毒素的产生。随着时间的延长病原菌粗毒素产生量逐渐增加，在15 d时达到最大。病原菌毒素活性测定结果显示，针刺接种的离体叶片在48 h后即可产生直径为1cm的病斑，幼苗浸渍在毒素中48 h后萎蔫，由此可知病原菌粗毒素的致病性较高。在10种供试寄主植物中，病原菌粗毒

素可以侵染7种，其中大豆、茄子、菜豆等测试植株病斑最大达到1cm以上，从而证明其侵染寄主范围之广。因此，在生产实践中，应将豇豆与大豆、茄子、菜豆等敏感作物分离种植，避免作物之间的交叉感染，引起病害的蔓延，造成经济损失。

本研究证实了豇豆轮纹病病菌粗毒素的致病性,明确了豇豆轮纹病病菌的产毒条件及致病性,为毒素的纯化和进一步深入研究其理化特性、活性组分、致病机理及利用毒素进行抗病品种筛选提供了理论基础。

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OptimizationofculturingconditionsfortoxinproductionbyCorynesporacassiicola

Liu Zhiheng1, Li Jianbing1, An Xin1, Li Wei1, Cao Youwen2, Wang Junhe1

(1.PlantProtectionCollege,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110866,China；2.PlantProtectionStationofZhangwuCounty,Fuxin123200,China)

Toxin production byCorynesporacassiicolawas investigated under different culture medium,culturing duration,temperature,pH,light or shaking conditions by determining the inhibitory rate of seed germination and germ growth.The results showed that toxin activity was different under different culture conditions.The optimal culture conditions were as follows: pH 7-8,20-25 ℃,culturing in Czapek’s liquid medium under light and shaking conditions for 15 h.Toxicity bioassay demonstrated that the crude toxin had high toxicity to soybeans and kidney beans with the larger lesion,while no toxicity to cucumber plants.

cowpea ring spot;Corynesporacassiicola; toxin; activity

2013-06-12

：2013-11-25

S 436.43

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.02.010

* 通信作者 E-mail: lzhh1954@163.com