珍珠龙胆石斑鱼肠道枯草芽孢杆菌的分离鉴定及产酶能力分析

王成强，王际英，黄炳山，李宝山

(山东省海洋资源与环境研究院，山东省海洋生态修复重点实验室，山东 烟台 264006)

随着水产养殖集约化的不断发展，养殖生态环境日益恶化，病害频发，同时抗菌药物的限用，“无抗”生态化养殖势在必行，使得水产养殖业面临非常严峻的考验。为此，众多学者致力于各种抗菌药物替代品的研究，益生菌(乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌等制剂)因具有安全性高、促进动物生长、提高机体免疫能力以及改善水质等优点，成为了近年来的研究热点[1-2]。2003年我国农业部公布了能够用于生产微生态制剂的菌种，包括枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)等。枯草芽孢杆菌是一种短杆状、无荚膜、能运动的革兰氏阳性细菌，能产中生芽孢，广泛分布于土壤、湖泊、海洋、动植物体表及其栖息地。一系列研究均表明[3-5]，饲料中添加枯草芽孢杆菌能够改善动物消化道内环境、促进动物生长、提高动物机体免疫力及产生多种酶类、提高消化酶活性等，因此枯草芽孢杆菌具有广阔的发展前景。

本研究拟从健康的珍珠龙胆石斑鱼(Epinephelusfuscoguttatus♀ ×Epinepheluslanceolatus♂)肠道中分离原籍芽孢杆菌，确保了菌株能更加容易地适应珍珠龙胆石斑鱼肠道的环境，有利于芽孢杆菌在肠道中存活和繁殖，发挥菌株的益生性，并对其产酶能力进行分析，旨在筛选出性能稳定、益生性好的菌株，为以后研究石斑鱼益生菌饲料添加剂和发酵饲料提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品处理

选取体重为300 g左右，健康、活力好的珍珠龙胆石斑鱼。参考贺国龙等[6]方法进行，并稍作修改，首先将石斑鱼用丁香酚(1∶10 000)(上海试剂，中国)进行麻醉，之后用75%酒精棉球消毒鱼体表，打开腹腔，再用酒精棉球拭擦肠管外壁，并用无菌水冲洗数遍后，小心取出肠道组织，放置于50 mL无菌离心管中，剪碎匀浆，制成原液，将原液置于70℃恒温水浴锅中水浴30 min。

1.1.2 培养基

普通营养琼脂、蛋白酶培养基、淀粉酶培养基和纤维素酶培养基均购自北京奥博星生物技术公司。

常规方法制备营养琼脂平板，置于37℃恒温箱16～24 h备用。

1.2 细菌的分离与方法

参照贺国龙等[6]操作方法：将高温处理后的原液做适量的稀释后涂布于琼脂平板上，然后置于37℃恒温培养箱中培养24 h。挑选琼脂平板上单个灰白色，边缘不规则、不整齐、表面粗糙而且干燥的菌落进行纯化培养，并在制作成斜面后做进一步的鉴定。

1.3 细菌的生理生化鉴定

细菌的生理生化鉴定参考东秀珠等[7]的方法。

1.4 细菌的16S rDNA鉴定

将斜面保存的菌株送至上海生工生物工程股份有限公司进行菌种鉴定。基本方法：首先提取细菌基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用细菌16S rDNA通用引物(7F：5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’，1540R：5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)，PCR扩增所筛选出菌株的16S rDNA，PCR长度为1 500 bp左右。PCR反应程序：94℃预变性 4 min；94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min。之后进行测序处理。

1.5 细菌菌属的确定

根据测定的基因序列，通过NCBI/BLAST/blastn软件(http：//blast.Bcbi.Nlm.Nih.gov)，在NCBI的数据库中查找同源序列，进行同源性比较，确定待测菌种的种属分类。根据Fox等[8]研究表明，同源性大于99%的细菌判定为同种细菌；同源性介于95%～99%判定为同属；同源性在91%～95%判定为同科。

1.6 产酶能力分析

采用平板透明圈法，将已鉴定的菌株接种于牛肉蛋白胨培养基中，摇床培养(37℃、160 r/min、10 h)，调整菌液浓度，使之达到1×108cfu/mL，用滤纸沾取菌液，分别点种于蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶的选择培养基平板上，每种处理设3个重复，37℃培养24 h，观察平板上有无水解圈及其大小，以水解圈直径/菌落直径的比值为指标表征产酶能力的大小[9]。

1.7 数据统计分析

采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，用平均值±标准误差(Mean±SD)来表示所得试验数据，另外用Tukey’s检验方法对试验数据进行多重比较，当P<0.05时表示结果具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 菌落形态结果

在珍珠龙胆石斑鱼肠道中筛选到4株疑似枯草芽孢杆菌的菌落，分别记做B1、B2、B3、B4，将4株菌分别划线接种于营养琼脂平板上，37℃培养18 h后，观察形成的菌落形态(图1)。B1：菌落表面干燥、褶皱、扁平、不透明、乳白色、边缘不整齐、直径2～5 mm的中大菌落；B2：菌落呈灰白色、无光泽，表面粗糙，菌落边缘不整齐，为干燥型菌落；B3：菌落呈灰白色、不透明，菌落边缘锯齿状，菌落中间突起，中间像一个圆形的火山口；B4：菌落呈灰白色，不透明，菌落边缘锯齿状，菌落中间突起，有皱褶。

2.2 菌株的生理生化特性

4株菌的生理生化试验结果见表1，根据《伯杰细菌鉴定手册》[10]和《常见细菌系统鉴定手册》[7]，4株菌的试验结果均符合枯草芽孢杆菌的生化特性，初步证明分离菌均为枯草芽孢杆菌。

表1 4株菌的生理生化试验结果

注：“+”表示阳性或生长，“-”表示阴性或不生长，“±”表示不明显。

Note：“+”showed positive or growth，“-”showed negative or no growth，“±”showed no obviousness.

2.3 分离菌株的PCR鉴定结果

通过上海生工生物工程股份有限公司分析，B1、B2、B3和B4等4株菌的琼脂糖凝胶电泳结果显示，在约1 500 bp处均有特异性条带出现，条带单一、明亮(图2)，证明4株菌可能均为芽孢杆菌属。

将纯化的PCR产物进行序列分析，得到4株菌的16S rDNA序列结果。同时，在NCBI的数据库中查找B1、B2、B3和B4菌株的16S rDNA基因序列的同源序列，将4株菌的16S rDNA与已经报道芽孢杆菌属的序列进行分析比较。结果显示，B1菌株的核苷酸序列与BacillussubtilisstrainYS52(KU551251.1)的同源性为99%；B2菌株的核苷酸序列与BacillussubtilisstrainDS62(KU551234.1)的同源性为99%；B3菌株的核苷酸序列与Bacillussubtilisstrain51(KX216383.1)的同源性为100%；B4菌株的核苷酸序列与BacillussubtilisstrainGQJK2(CP020367.1)的同源性为99%。经过16S rDNA基因序列比对发现，4株菌与枯草芽孢杆菌的同源性都达到99%以上，另外，利用DNAMAN 9软件对4株菌的16S rDNA序列结果进行BLAST比对，结果发现4株菌的同源性为96.43%，因此4株菌均被鉴定为枯草芽孢杆菌。4株菌的16S rDNA序列BLAST比对结果见图3。

2.4 分离菌株产纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶的能力

根据东秀珠等[2]方法，对分离菌株进行了产酶能力试验，测定了4株菌的水解圈直径和菌落直径，以水解圈直径/菌落直径为指标，比值越大，则产酶能力越强。由表2可以看出，4株菌都有产纤维素酶的能力，菌株的水解圈直径大小排序为B3>B2>B4>B1，4株菌的菌落直径大小无显著性差异(P>0.05)。B3菌株的水解圈直径/菌落直径比值最大，分别比B1、B2和B4大了34.01%、10.33%和24.44%，其中显著大于B1菌株(P<0.05)，同B2、B4菌株无显著性差异(P>0.05)。

表2 4株菌产纤维素酶的能力分析

注：表格中同列肩标相同小写字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同此。

Notes：In the same row，values with same small letter superscripts or no letter superscripts meant no significant differences(P>0.05)，different small letter superscripts meant significant differences(P<0.05).The same as the following tables.

由表3可以看出4株菌都有产淀粉酶的能力，菌株的水解圈直径大小排序为B3>B1>B2>B4，菌株的菌落直径大小排序为B4>B2>B1>B3。菌株的水解圈直径/菌落直径的比值大小排序为B3>B1>B2>B4，B3菌株比值显著大于B2、B4菌株(P<0.05)，同B1菌株比值大小无显著性差异(P>0.05)。

表3 4株菌产淀粉酶的能力分析

由表4可以看出，4株菌都有产蛋白酶的能力，菌株的水解圈直径大小排序为B3>B1>B2>B4，菌株的菌落直径大小排序为B1>B4>B3>B2。菌株的水解圈直径/菌落直径的比值大小排序为B2>B3>B1>B4，其中B2和B3菌株比值无显著性差异(P>0.05)，但显著大于B1、B4菌株(P<0.05)。

表4 4株菌产蛋白酶的能力分析

3 结语

本试验，从珍珠龙胆石斑鱼肠道中分离4株菌B1、B2、B3和B4，经菌落形态、生理生化试验以及16S rDNA序列比对，均鉴定为枯草芽孢杆菌，同时经过产酶能力的试验发现，4株菌都具有产纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶的能力，且B3菌株同其他3株菌株相比，其产纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶的能力都较强。菌株的产蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶的能力越强，酶系越全，其饲喂效果越好[11]。因此，本试验选取B3作为具有益生菌潜力的菌株，用于后续试验，预期将具有较好的饲喂效果和试验结果。