慢病毒介导的解整合素－金属蛋白酶17 RNA干扰对气道上皮细胞MMP-9表达及NF-κB活性的影响

严建平，李亚清，钟 晖，陈 淳，顾 超

肺组织弹性物质的降解是慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）特征性的病理表现［1］，也是导致COPD患者进行性气流受限的重要原因。蛋白酶－抗蛋白酶失衡在这一过程中发挥着重要作用。基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase，MMP-9）是基质金属蛋白酶（MMPs）超家族成员之一。活化的MMP-9可作用于弹性蛋白及IV型胶原等，引起细胞外基质损伤。MMP-9在COPD患者血清中的表达明显升高，且与气流受限和疾病进展相关［2］。Foronjy等［3］通过转基因小鼠实验研究表明MMP-9的过表达和酶活性增加可导致肺泡弹性物质的丢失、胶原含量减少，使肺组织发生肺气肿样改变。但其表达调控机制仍有待于研究。解整合素－金属蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase，ADAM）17属于ADAM蛋白酶家族成员之一，在与一系列生理、病理活动有关的关键因子的细胞外域分离（shedding）过程中起着重要作用，被称为“信号系统剪刀”。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α是一种具有广泛生物学活性的细胞因子，在机体细胞免疫应答、炎症反应及细胞死亡或生存等过程中起着重要作用。Wright等［4］研究表明香烟烟雾可通过 TNF-α信号通路上调肺血管MMP-9、MMP-2、MMP-12的表达。pro-TNF-α是可溶型TNF-α的前体，通过其胞外域水解脱落形成可溶型TNF-α，ADAM17在这一过程中起着重要作用。因此，我们推测ADAM17可能通过调控TNF-α信号转导在调节MMP-9表达中发挥作用。

RNAi（RNA interference）技术是一种新兴的由外源性或细胞内源性的双链RNA介导的转录后基因沉默技术，已在基因功能、发育生物学和基因治疗等研究有了广泛的应用［5］。慢病毒载体介导的RNAi不但可以感染非分裂期细胞，还具有容纳外源性目的基因片段大、目的基因能长期稳定表达、免疫反应小等优点。因此，本课题通过构建ADAM17 siRNA慢病毒表达载体，探讨ADAM17 RNAi对脂多糖（LPS）诱导的 HBE4-E6／E7细胞 MMP-9表达的影响，并进一步研究 TNF-α／核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信号通路在其中的作用，为治疗COPD提供新的研究靶点。

1 材料

1.1 细胞株 正常人气道上皮细胞系HBE4-E6／E7购自美国ATCC公司，293T细胞系购自上海中科院细胞库。

1.2 试剂和仪器 慢病毒包装系统 pLVTHM、pRsv-REV、pMDlg-pRRE和pMD2G-VSVG购自Trono（University of Geneva，Switzerland）.ClaI，MluI，XbaI和 EcoRI购自 TaKaRa（Otsu，Shiga，Japan）。AxyPrep质粒小剂量制备试剂盒购自Axygen公司。脂质体Lipofectamine 2000和大肠杆菌菌株DH5α购自Invitrogen（Carlsbad，CA，USA）。胎牛血清购自美国Gibco公司。RNAex购自上海华舜公司。MMLV逆转录酶、RNasin购自 Promega（Madison，WI，USA）。SYBR Master Mixture购自 Toyobo公司。Taq DNA聚合酶购自北京天为时代公司。LPS（来源于E.coli 0111∶B4）、DMEM培养液、吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）、明胶购自美国Sigma公司。Etanercept购自美国Immunex公司。兔抗人MMP-9单克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司。NE-PER细胞核和细胞质蛋白质提取试剂盒以及LightShiftTMChemiluminescent EMSA试剂盒购自美国Pierce公司。二氧化碳培养箱为美国Thermo公司，倒置相差显微镜为日本OLYMPUS公司。

2 方法

2.1 ADAM17 siRNA设计、质粒载体构建及慢病毒包装 根据人ADAM17 mRNA序列（Genebank number：NM＿003183）选择位于2021-2041之间的特殊序列 5′-CCTATGTCGATGCTGAACAAA-3′为干扰靶序列。含干扰靶序列的DNA寡核苷酸由上海生物工程有限公司化学合成。并经过退火，以ClaI和MluI双酶切，在 T4 DNA连接酶的作用下插入pLVTHM表达载体。制备DH5α大肠杆菌感受态细胞，转化，挑选阳性克隆，通过限制酶切和DNA直接测序鉴定。取对数生长期的293T细胞，调整细胞密度为0.5×109cells·L－1。取20μg重组 pLVTHM载体，10μg pMD2G-VSVG，10μg pMDlg-pRRE和10μg pRsv-REV加入无菌水定容至1 800μl，再加入 CaCl2（2.5 mol·L－1）溶液 200μl，混匀，加入 2×BBS缓冲盐溶液2 000μl，室温放置30 min形成转染复合物。当293T细胞密度达60%～70%时，将转染复合物和磷酸钙混合液转移至含单层细胞的培养液中，混匀，培养12 h后弃去培养液，PBS反复冲洗3次。加入细胞培养液培养72 h；收集上清液，4℃、4 000 r· min－1离心 10 min，0.45μm滤器过滤上清液，离心后于－80℃冰箱保存。以慢病毒浓缩液感染293T细胞，采用倍比稀释法和流式细胞术（FACS）检测病毒滴度。

2.2 细胞培养与分组 HBE4-E6／E7细胞复苏后用含10% 胎牛血清、105U·L－1青霉素、100 mg·L－1链霉素DMEM培养液混悬细胞，充分混匀，在37℃、5%CO2条件下培养2.5 h后，消化、收集细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养液混悬细胞，调整细胞浓度约为1×109cells·L－1，进一步培养。在细胞信号转导实验中，将HBE4-E6／E7细胞分成4组：第 3、4组分别以 1 mg·L－1etanercept（A recombinant human TNFR p75-Fc fusion protein）（Enbrel，Immunex，Seattle）、50 mg·L－1PDTC预处理30 min；接着第2、3、4组分别加入终浓度为100μg·L－1LPS刺激24 h，第1组未用 LPS刺激。在RNAi干扰实验中，一方面将HBE4-E6／E7细胞分成4组：第1组为空白对照组；第2组为LPS刺激组；第3组以LV-NC-siRNA慢病毒以MOI 15感染HBE4-E6／E7细胞72 h，第4组以 LV-ADAM17-siRNA慢病毒以MOI 15感染HBE4-E6／E7细胞72 h，接着第3、4组以100μg·L－1LPS刺激24 h。另一方面将A549细胞分成4组：第1组为空白对照组；第2组为TNF-α刺激组；第3组以LV-ADAM17-siRNA慢病毒以MOI 15感染HBE4-E6／E7细胞72 h，接着以1 mg·L－1TNF-α刺激24 h；第4组以50 mg·L－1PDTC预处理 HBE4-E6／E7细胞30 min，接着以1 mg·L－1TNF-α刺激24 h。分别收集各组细胞及细胞上清液，－80℃冰箱保存、备测。

2.3 逆转录－聚合酶链反应 以TRIzol提出总RNA。按MMLV逆转录酶试剂盒说明合成cDNA：将2μg RNA与2μl Oligo（dT）15（0.5 g·L－1）混合，补充DEPC处理的无菌水至总体积为12μl，离心，70℃温育5 min，迅速置冰上，分别加入5×buffer 5μl，RNase（40 U·μl－1）0.6μl，dNTP（10 mmol·L－1）1.25μl，MMLV（200 U·μl－1）1μl，补充DEPC处理的超纯水至总体积为25μl，离心，37℃温育1h，95℃5 min以灭活逆转录酶。根据目的基因分别加入：10×buffer 2.5μl，MgCl2（25 mmol·L－1）2.0μl，dNTP（10 mmol·L－1）1.0μl，上游引物（10μmol·L－1）1.0μl，下游引物（10μmol·L－1）1.0μl，逆转录产物 2.5μl，Taq酶 0.5μl，补充无菌去离子水至总体积为25μl，离心混匀，95℃预变性5 min，然后完成35个循环，PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，用UVP-GDS8000凝胶成像分析系统进行拍照、图像灰度分析，将目的基因扩增片段灰度值与内参照β-actin扩增片段灰度值的比值作为目的基因mRNA表达的定量指标。引物见Tab 1，由北京奥科生物科技公司设计和合成：MMP-9（Genebank：NM＿004994）引物，上游 5′-TTGACAGCGACAAGAAGTGG-3′； 下 游 5′-GGCACAGTAGTGGCCGTAG-3′，产物 388bp。β-actin上游 5′-GGCACCACACCTTCTACAATGA-3′；下 游 5′-TCAGGAGGAGCAGCAATGATCTTG-3′，产物 745 bp。

Tab 1 Primer sequences and reaction conditions used for reverse transcriptase polymerase chain reaction

2.4 酶联免疫吸附试验 收集各组细胞上清液，2 000 r·min－1离心5 min，弃去沉淀，以 ELISA法检测细胞上清液中的TNF-α浓度。根据TNF-αELISA试剂盒说明书进行操作，主要步骤如下：每孔加入100μl稀释液 RD1-85。分别加入50μl标准品、对照品或待测样品。室温温育2 h后吸干，反复洗涤4次。每孔加入100μl TNF-α结合物，室温温育1 h。吸干，洗涤4次。每孔加入200μl底物溶液，避光室温温育30 min。每孔加入50μl终止液终止反应，30 min内在450 nm测定其吸光值。

2.5 Western blot 将各组含20μg蛋白的上清液在100℃沸水中变性5 min，分别上样于8%SDSPAGE加样孔中，电泳。当溴酚蓝染液移至胶底边时，取下凝胶，4℃、350 mA电转移1 h，将蛋白转至硝酸纤维膜上。接着将硝酸纤维素膜置于TBS-T（TBS、5%脱脂奶粉、0.1%Tween）中室温孵育1 h。然后将硝酸纤维素膜在以1∶2 500稀释的兔抗人MMP-9单克隆抗体中室温孵育1 h。TBS-T洗膜5次后，将硝酸纤维素膜在以1∶40 000稀释的辣根酶标记山羊抗兔IgG（H＋L）中室温孵育1 h。TBST洗膜5次后以增强化学发光法（enhanced chemiluminescence solution，ECL）显影。用 UVP-GDS8000凝胶成像分析系统进行扫描摄像、图像灰度分析。

2.6 凝胶阻滞分析实验 用NE-PER细胞核和细胞质蛋白质提出试剂盒提出细胞核蛋白，按试剂盒说明操作。由北京奥科生物科技公司设计、合成NF-κB双链寡核甘酸探针。生物素标记NF-κB探针序列，x代表生物素：5′-xGCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT-3′（a），5′-xAGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′（b）。未用生物素标记 NF-κB探针序列：5′-GCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT-3′（a），5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′（b）。以 Light-ShiftTMChemiluminescent EMSA试剂盒检测 NF-κB活性，步骤如下：制备5% 非变性聚丙烯酰胺凝胶，100 V预电泳30 min，室温孵育含50μg·L－1Poly（dI·dC）、0.05%NP-40、50 mmol·L－1KCl、5 mmol·L－1MgCl2、10 mmol·L－1EDTA的结合反应体系20 min后，加入5μl的5×loading buffer，混匀后取20μl结合反应体系上样，100 V电泳，接着以380 mA（～100V）电转移1 h，使结合反应体系至尼龙膜上。将膜置于干燥的纸上（有溴酚兰面朝上）1 min，迅速用254 nm紫外灯距离膜0.5 cm处紫外交联10 min。以ECL方法显影，用UVP-GDS8000凝胶成像分析系统扫描、分析条带，根据其灰度值分析NF-κB活性。

2.7 统计学方法 采用SPSS 11.5统计软件包进行统计学分析，实验数据以¯x±s表示，统计学分析采用配对t检验和单因素方差分析（组间差异用F检验，组间两两比较用q检验）。

3 结果

3.1 Etanercept和 PDTC对 LPS诱导的 HBE4-E6／E7细胞MMP-9的表达及NF-κB活性的影响在LPS刺激下，HBE4-E6／E7细胞中MMP-9 mRNA和蛋白表达明显增加（P＜0.05），见Fig 1；NF-κB的活性在LPS刺激下亦明显增加（P＜0.05），见Fig 2。Etanercept和 PDTC明显抑制 LPS诱导的MMP-9 mRNA和蛋白的表达（P＜0.05），见 Fig 1；Etanercept和PDTC亦明显抑制LPS诱导的NF-κB的活性（P＜0.05），见 Fig 2。

3.2 慢病毒介导的ADAM17 RNAi对LPS诱导的MMP-9表达及NF-κB活性的影响 慢病毒介导的ADAM17 RNAi可明显降低HBE4-E6／E7细胞上清液中 TNF-α蛋白水平（P＜0.05），见 Fig 3，并明显抑制LPS诱导的MMP-9 mRNA和蛋白表达（P＜0.05），见Fig 4；当以 LV-ADAM17-siRNA重组慢病毒感染HBE4-E6／E7细胞72 h，再以LPS刺激24 h，LPS诱导的 NF-κB的活性明显下降（P＜0.05），见Fig 5。而当以 LV-NC-siRNA重组慢病毒感染HBE4-E6／E7细胞72 h后再以 LPS刺激24 h，和仅以LPS刺激组比较，LPS诱导的MMP-9 mRNA和蛋白表达及NF-κB的活性均无明显变化（P＞0.05），见 Fig 4，5。

Fig 1 Effects of Etanercept and PDTC on MMP-9 mRNA（A and B）and protein（C and D）expressions induced by lipopolysaccharide（n＝6）

Fig 2 Effects of etanercept and PDTC on NF-κB activity induced by lipopolysaccharide（n＝4）

Fig 3 Effects of ADAM17 RNAi on TNF-αexpression of airway epithelial cells induced by lipopolysaccharide（n＝6）

Fig 4 Effects of ADAM17 RNAi on MMP-9 mRNA（A and B）and protein（C and D）expressions induced by lipopolysaccharide（n＝6）

Fig 5 Effects of ADAM17 RNAi on NF-κB activity induced by lipopolysaccharide（n＝4）

3.3 慢病毒介导的 ADAM17 RNAi不能阻断TNF-α诱导的 MMP-9表达及 NF-κB活性 在TNF-α刺激下，HBE4-E6／E7细胞中 MMP-9 mRNA和蛋白的表达明显增加（P＜0.05），见 Fig 6，TNF-α可诱导NF-κB活性明显升高（P＜0.05），见Fig 7。以LV-ADAM17-siRNA重组慢病毒感染HBE4-E6／E7细胞72 h后再以TNF-α刺激24 h，和仅以TNF-α刺激组比较，TNF-α诱导的MMP-9 mRNA和蛋白表达及NF-κB的活性均无变化（P＞0.05），见 Fig 6，7。PDTC则明显抑制TNF-α诱导的MMP-9 mRNA和蛋白表达及 NF-κB的活性（P＜0.05），见 Fig 6，7。

4 讨论

NF-κB是一种多向性核转录因子，因其与免疫球蛋白κ轻链基因的增强子结合而得名。NF-κB广泛存在于各种细胞中，可被TNF-α、LPS等多种因素激活，参与调控IL-8、TNF-α等多种基因的表达，在调节炎症反应、机体免疫功能等过程中发挥重要作用［6－7］。PDTC是 NF-κB活化的特殊抑制剂，可抑制IκBα的降解、阻止IκB和 NF-κB复合体的解离，从而抑制NF-κB的活化过程［8］。本研究中 LPS刺激使HBE4-E6／E7细胞MMP-9表达明显增加，NF-κB活性亦明显升高，etanercept和PDTC则均可阻断这一过程。这说明 TNF-α／NF-κB信号通路在LPS诱导的HBE4-E6／E7细胞MMP-9表达中起重要的调控作用。Hozumi等［9］通过离体实验研究也表明TNF-α刺激可通过NF-κB信号转导途径调节正常人支气管上皮细胞MMP-9表达。

Fig 6 Effects of ADAM17 RNAi on MMP-9 mRNA（A and B）and protein（C and D）expressions induced by TNF-α（n＝6）

Fig 7 Effects of ADAM17 RNAi on NF-κB activity of airway epithelial cells induced by TNF-α（n＝4）

ADAM-17在proTNF-α转化成可溶的TNF-α中起重要作用，虽然 MMP-7、MMP-14、MMP-17、ADAM-10也与 proTNF-α的脱落有关，但是 ADAM-17对proTNF-α的脱落作用是最强的，且其对 proTNF-α脱落特异性是其他MMP对proTNF-α脱落特异性的100～1 000倍，故 ADAM-17又称 TNF-α转化酶（tumour necrosis factor-α converting enzyme，TACE）［10］。ADAM-17最显著的功能是分离 TNF-α、表皮生长因子、肝素结合样表皮生长因子、转化生长因子-α等多种跨膜蛋白的胞外域［11］。本研究中LPS刺激使HBE4-E6／E7细胞上清液TNF-α水平明显升高，而慢病毒介导的ADAM17 RNAi可降低LPS诱导的 HBE4-E6／E7细胞 TNF-α表达，明显抑制LPS诱导的NF-κB活性，使LPS诱导的MMP-9的表达相应地明显降低。但慢病毒介导的ADAM17 RNAi不能阻断以TNF-α直接刺激所引起的MMP-9表达增加和NF-κB活性升高；而PDTC则仍可抑制TNF-α直接刺激引起NF-κB活化，并使TNF-α直接诱导的MMP-9表达明显下降。说明ADAM17是通过调节TNF-α细胞外域脱落参加调节LPS诱导的MMP-9表达过程，但不能直接阻断TNF-α下游的信号转导。

因此，本研究发现TNF-α／NF-κB信号通路在LPS诱导的MMP-9表达中起重要调控作用，慢病毒介导的 ADAM17 RNAi可通过阻断 TNF-α／NF-κB信号通路的上游来调节LPS诱导的气道上皮细胞MMP-9的表达，为COPD的治疗提供了新的研究靶点。

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