依达拉奉保护H9c2心肌细胞对抗阿霉素的心肌毒性作用

刘广交，郭润民，徐文明，沈 宁，冯鉴强，廖新学

阿霉素（doxrubicin，DOX）常被用来治疗急性白血病、淋巴瘤、骨肿瘤、乳腺癌和卵巢癌等恶性肿瘤［1］。但是，由于它能引起剂量依赖性的心肌毒性，故限制了其在临床上的应用［2－3］。现有的基础研究与临床研究证实，引起DOX心肌毒性的病理生理机制是多方面的，其中氧化应激和心肌凋亡可能是重要的机制，有报道指出，DOX能引起活性氧（ROS）生成增多及心肌细胞凋亡［4］。最近，我们也证实，DOX能引起内质网应激和氧化应激（ROS生成增多），此作用与心肌毒性有关；ROS的清除剂——N乙酰半胱胺酸（N-acetyl-L-cyteine，NAC）可保护H9c2心肌细胞对抗DOX心肌毒性［5］。但是，在临床上，应用抗氧化剂，例如，维生素E（vitamin E）等未能取得满意的心肌保护效果［6］，这一方面提示除了ROS过度生成以外，其他的机制，如心肌炎症、信号通路的功能变化可能也在DOX心肌毒性的产生中起着重要的作用；另方面，提示需寻找新型的抗氧化剂以观察其抗DOX心肌毒性的效果。

依达拉奉（edaravone，EDA），又名 MCI-186，是一种新型的自由基清除剂。自2001年起，已在日本用于治疗大脑缺血性疾病，被证实具有神经保护作用［7］。值得注意的是，EDA可有效地清除心脏的ROS［8］。近年，有报道指出，EDA能保护心肌细胞对抗DOX引起的心肌毒性［9－10］，但是，其作用机制尚未完全明确，为此，本文应用DOX损伤H9c2心肌细胞，重点探讨EDA能否通过抗氧化作用及线粒体保护作用保护心肌细胞对抗DOX心肌毒性，为深入阐明EDA的心肌保护作用提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 EDA由南京先声东元制药有限公司供给。阿霉素、Hoechst 33258、罗丹明123（Rh123）、双氯荧光素（DCFHDA）购自 Sigma Aldrich公司（USA）。细胞计数试剂盒 8（cell counter kit-8，CCK-8）由Dojindo Lab（日本）提供。DMEM-F12培养基以及特级胎牛血清（FBS）购自 Gibco BRL（USA）。抗 cleaved caspase-3抗体购自 Cell Signaling Technology Inc（CST）。

1.2 细胞培养与处理方法 H9c2细胞来源于大鼠胚胎期心脏组织，由中山大学实验动物中心提供。在37℃、5%CO2的条件下，培养于含有15%胎牛血清的DMEM-F12培养基中。EDA预处理按如下目的与步骤实施：（1）观察不同浓度EDA对DOX损伤心肌作用的影响：应用20、40、80μmol·L－1EDA分别预处理H9c2心肌细胞60 min，接着给予55μmol·L－1DOX处理心肌细胞24 h；（2）观察应用40 μmol·L－1EDA预处理不同时间对DOX损伤心肌作用的影响；接着给予5μmol·L－1DOX作用24 h。

1.3 CCK-8测定细胞存活率 H9c2心肌细胞接种于96孔培养板中，当细胞生长到培养孔约80%面积时，根据实验需要进行不同的处理：（1）5 μmol·L－1DOX培养 24 h；（2）40μmol·L－1EDA提前60 min加入培养基中作为预处理，然后更换成5μmol·L－1DOX培养24 h；每个处理因素设4个复孔。终止培养后，每孔加入10μl CCK-8，轻摇，37℃孵育2 h，用酶标仪（λ＝450 nm）记录各孔的吸光度（OD）。取4孔OD值的平均数，按下列公式计算细胞存活率：细胞存活率／%＝处理组OD／对照组OD×100%，重复3次。

1.4 Hoechst 33258核染色法检测细胞凋亡H9c2心肌细胞经不同因素处理后，小心弃去培养基，PBS洗1遍，4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗后，加入5 mg·L－1Hoechst 33258试剂，室温轻摇30 min。在荧光显微镜（BX50-FLA，Olympus，Japan）下摄片，染色质均匀分布，核被染成均匀蓝色的细胞认为是正常细胞，核呈浓缩、碎裂的明亮蓝色细胞认为是凋亡细胞，随机选取视野在荧光显微镜下摄片。

1.5 Western blot测定 caspase-3蛋白的表达H9c2心肌细胞接种于60 mm培养皿中，各实验组给予不同的处理因素后，用预冷的PBS洗2次，加入细胞裂解液，4℃静置 30 min，12 000 r·min－1离心10 min，取上清，采用BCA法进行蛋白定量。总蛋白经SDSPAGE分离后，转移到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭 1.5 h，随后加入抗 cleavedcaspase-3抗体 （1∶1 000，4℃过夜，用 TBST洗 3次，10 min／次。将PVDF膜用发光试剂ECL显色，暗室曝光到X线片上，凝胶成像系统扫描分析结果。

1.6 细胞内ROS水平的测定 DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜。进入细胞后，可被细胞内的酯酶水解成DCFH，而DCFH不能自由通透细胞膜，从而将探针装载到细胞内。细胞内的ROS可将无荧光的DCFH氧化成发出绿色荧光的DCF。绿色荧光的强弱可以间接反映细胞内 ROS的水平。将赖氨酸包被的盖玻片置于6孔培养板内，H9c2心肌细胞被均匀地接种于盖玻片上。当细胞生长到培养孔约80%面积时，根据实验需要给予相应的处理：（1）5μmol·L－1DOX处理 24 h；（2）40μmol·L－1EDA预处理60 min后，再用5μmol·L－1DOX处理 24 h；（3）单纯用 40μmol·L－1EDA处理60 min。每组均包括3个复孔。处理完成后，用 PBS漂洗盖玻片2次，用10μmol·L－1DCFH-DA染液于37℃孵育30 min。在荧光显微镜下随机选取5个不重复区摄片，用ImageJ 1.410软件分析5个视野绿色荧光强度的平均值，再对每组的各样本进行统计分析。

1.7 线粒体膜电位（mitochondrial membrance potential，MMP）的检测 当细胞生长到约80%融合时，根据实验需要给予不同的条件培养基。处理结束后，用PBS洗2次，在含100μg·L－1Rh 123的无血清培养基中37℃孵育30 min。在荧光显微镜下随机选取3个不重复区摄片，细胞核周围绿色的亮点即为摄取了Rh123的线粒体。用ImageJ1.410软件对绿色荧光强度进行半定量分析。

1.8 统计学方法 所有结果以¯x±s表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），用LSD-t进行均数之间的比较，实验数据用SPSS 13.0软件进行统计分析。

2 结果

2.1 EDA抑制DOX诱导的心肌细胞毒性 根据我们的前期研究结果［5］，本实验选用5μmol·L－1作为DOX的有效损伤浓度，24 h作为有效的损伤时间。Fig 1A显示，5μmol·L－1DOX处理H9c2心肌细胞24 h能引起明显的细胞毒性，表现为心肌细胞的存活率明显降低（P＜0.01）。在应用5μmol·L－1DOX处理 H9c2心肌细胞前，应用不同浓度（20、40、80μmol·L－1）的 EDA分别预处理60 min，均能抑制DOX的心肌细胞毒性，使细胞存活率升高，其中40μmol·L－1EDA的保护作用最明显。在此研究基础上，本文观察到应用40μmol·L－1EDA预处理心肌细胞不同时间（30、60、90、120 min）均能明显地保护心肌细胞对抗DOX的细胞毒性，其中预处理60 min的心肌保护作用最大（Fig 1B）。因此，本文选用了浓度为40μmol·L－1，时间为60 min作为EDA预处理的参数。

Fig 1 Inhibitory effect of EDA on DOX-induced cytotoxicity in H9c2 cardiac cells

2.2 EDA抑制DOX诱导的心肌细胞凋亡 Fig 2A的Hoechst 33258核染色检测结果显示，5μmol·L－1DOX处理 H9c2心肌细胞24 h能使凋亡H9c2细胞数量明显增多。在DOX处理细胞前应用40μmol·L－1EDA预处理60 min可明显地减少凋亡细胞的数量，与DOX损伤组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。40μmol·L－1EDA处理 H9c2细胞60 min不引起细胞凋亡（Fig 2B）。

Fig 2 Inhibitory effect of EDA on DOX-induced apoptosis in H9c2 cardiac cells

Fig 3A和3B的Western blot检测结果显示，应用5μmol·L－1DOX处理 H9c2心肌细胞6、12和24 h均能上调cleaved（代表激活）caspase-3表达，其中12 h时，cleaved caspase-3表达达到高峰。但是，40μmol·L－1EDA预处理H9c2细胞60 min能明显地抑制DOX对cleaved caspase-3表达的上调作用（Fig 3C和3D）。EDA本身不影响cleaved caspase-3的基础表达。

2.3 EDA抑制DOX诱导的氧化应激 Fig 4显示，正常心肌细胞内存在少量的的 ROS，但是，5 μmol·L－1DOX处理H9c2心肌细胞24 h使胞内ROS水平明显增多，与对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）。40μmol·L－1EDA预处理60 min能明显地抑制DOX诱导的氧化应激，使胞内ROS明显减少（P＜0.05）。EDA本身不影响ROS生成。

Fig 3 Inhibitory effect of EDA on the increased expression of cleaved caspase-3 by DOX-treatment in H9c2 cells（n＝5）

2.4 EDA抑制DOX诱导的MMP丢失 Fig 5显示，5μmol·L－1DOX处理H9c2细胞6 h可使MMP明显降低，但是40μmol·L－1EDA预处理60 min能明显地降低DOX对线粒体的损伤作用，使MMP升高（P＜0.05）。EDA预处理本身不影响MMP。

3 讨论

临床上，由于许多与缺血性相关的心脏疾病的心肌损伤与氧化应激有关，因此，通过抑制氧化应激从而保护心肌已成为一种治疗策略。近年，新型的自由基清除剂EDA的心肌保护作用日益受到重视。有临床研究报道，EDA对急性心肌梗死的患者具有较长期的改善作用。在离体的大鼠心脏实验，EDA能抑制缺血／再灌注引起的心肌损伤［11］。本研究小组也证实，EDA可保护H9c2心肌细胞对抗异丙肾上腺素引起的心肌损伤和氧化应激反应［12］。值得注意的是，有报道证实，EDA可保护大鼠［9］和狗［10］的心肌对抗DOX引起的心肌毒性，但是，EDA抑制DOX引起的心肌毒性的作用机制仍未完全清楚。

Fig 4 EDA inhibits the ROS generation induced by DOX in H9c2 cells（n＝5）

Fig 5 EDA attenuates DOX-induced loss of MMP in H9c2 cells

本研究观察到，应用DOX处理H9c2心肌细胞能引起明显的损伤，表现为心肌细胞的存活率降低，凋亡细胞数量增多，活化的caspase-3表达增多、ROS生成增多及 MMP丢失，这与先前的报道［4－5］相一致。重要的是，本研究证实EDA能抑制DOX引起的心肌细胞毒性及致凋亡作用，使细胞存活率增多，凋亡细胞数量及活化的caspase-3表达均减少，这与最近的研究［9－10］相一致。值得注意的是，本研究进一步证实EDA能抑制DOX引起的心肌细胞内ROS堆积。由于我们已证实ROS清除剂NAC能抑制DOX引起的心肌细胞毒性及胞内ROS堆积［5］，这与本研究的结果相似，提示EDA的抗DOX心肌毒性作用可能与其抑制ROS过度生成有关。黄涌等［12］也报道，EDA与NAC能抑制异丙肾上腺素诱导的心肌细胞毒性和胞内ROS堆积，支持本文的实验结果。

另方面，Shi等［13］指出，DOX可通过损伤心肌线粒体继而引起心肌细胞凋亡。因此，本文观察了EDA的线粒体保护作用。研究结果表明，EDA也能保护H9C2心肌细胞对抗DOX引起的MMP丢失，表明保护线粒体功能可能是EDA心肌保护作用的另一作用机制。在化学性低氧模拟剂氯化钴（CoCl2）引起的心肌细胞损伤模型［14－15］，EDA能抑制CoCl2对MMP的损伤作用［15］，这为本文提供了有力的依据。

综上所述，本文证实新型的自由基清除剂EDA能保护H9c2心肌细胞对抗DOX心肌毒性，此保护作用可能与其抗氧化作用、线粒体保护及抗凋亡作用等有关。由于本文未观察EDA与其他抗氧化剂（如vitamin E等）的作用比较，因此，今后尚需开展有关这方面的比较研究。

参考文献：

［1］ Danesi R，Fogli S，Gennari A，et al.Pharmacokinetic-pharmacodynamic relationships of the anthracycline anticancer drugs［J］.Clin Pharmacokinet，2002，41：431－44.

［2］ Hrdina R，Gersl V，Klimtova I，et al.Anthracycline-induced cardiotoxicity［J］.Acta Med（Hradec Kralove），2000，43（3）：75－82.

［3］ Scully R E，Lipshultz S E.Anthracycline cardiotoxicity in longterm survivors of childhood cancer［J］.Cardiovasc Toxicol，2007，7（2）：122－8.

［4］ Mukhopadhyay P，Rajesh M，Batkai S，et al.CB1 cannabinoid receptors promote oxidative stress and cell death in murine models of doxorubicin-induced cardiomyopathy and in human cardiomyocytes［J］.Cardiovasc Res，2010，85：773－84.

［5］ Wang X Y，Yang C T，Zheng D D，et al.Hydrogen sulfide protects H9c2 cells against doxorubicin-induced cardiotoxicity through inhibition of endoplasmic reticulum stress［J］.Mol Cell Biochem，2012，363（1－2）：419－26.

［6］ Berthiaume J M，Oliveira PJ，Fariss M W，Wallace K B.Dietary vitamin E decreases doxorubicin-induced oxidative stress without preventing mitochondrial dysfunction［J］.Cardiovasc Toxicol，2005，5：257－67.

［7］ Chen H，Wang S，Ding J H，Hu G.Edaravone protects against MPP＋-induced cytotoxicity in rat primary cultured astrocytes via inhibition of mitochondrial apoptotic pathway［J］.J Neurochem，2008，106：2345－52.

［8］ Tsujimoto I，Hikoso S，Yamaguchi O，et al.The antioxidant edaravone attenuates pressure overload-induced left ventricular hypertrophy［J］.Hypertension，2005，45：921－6.

［9］ Ikegami E，Fukazawa R，Kanbe M，et al.Edaravone a potent free radical scavenger，prevents anthracycline-induced myocardial cell death［J］.Circ J，2007，71：1815－20.

［10］Xin Y F，Zhang S，Gu L Q，et al.Electrocardiographic and biochemical evidence for the cardioprotective effect of antioxidants in acute doxorubicin-induced cardiotoxicity in the beagle dogs［J］.Biol Pharm Bull，2011，34（10）：1523－6.

［11］Minhaz U，Tanaka M，Tsukamoto H，et al.Effect of MCI-186 on postischemic reperfusion injury in isolated rat heart［J］.Free Radic Res，1996，24（5）：361－7.

［12］黄 涌，阮经文，杨春涛，等.依达拉奉保护H9c2心肌细胞对抗异丙肾上腺素诱导的氧化应激及内质网应激反应［J］.中国药理学通报，2011，27（3）：410－5.

［12］Huang Y，Ruan J W，Yang C T，et al.Myocardial protection of edaravone against isoprenaline-induced oxidative stress and endoplasmic reticulum stress in H9c2 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27（3）：410－5.

［13］Shi Y，Moon M，Dawood S，et al.Mechanisms and management of doxorubicin cardiotoxicity［J］.Herz，2011，36：296－305.

［14］廖新学，杨春涛，杨战利，等.硫化氢对抗化学性缺氧引起的心肌细胞损伤及其机制［J］.中国药理学通报，2009，25（8）：1012－7.

［14］Liao X X，Yang C T，Yang Z L，et al.Hydrogen sulfide protects H9c2 cells against chemical hypoxia-induced injury and the underlying mechanisms［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25（8）：1012－7.

［15］张蔼玲，兰爱平，郑东诞，等.依达拉奉保护H9c2心肌细胞对抗化学性低氧引起的损伤［J］.中国动脉硬化杂志，2012，20（4）：304－8.

［15］Zhang A L，Lan A P，Zhen D D，et al.Edaravone protects H9c2 cells against chemical hypoxia-induced injury［J］.Chin J Arterioscler，2012，20（4）：304－8.