Rho激酶抑制剂DL0805-0对大鼠离体胸主动脉的舒张作用及机制研究

阎 雨，王夙博，袁天翊，焦晓臻，谢 平，方莲花，，杜冠华，

Rho激酶（Rho-associated coiled-coil forming protein serine／threonine kinase，ROCK）是小G蛋白Rho的底物，具有丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶活性，广泛分布于脑、心脏、肺等大部分器官，具有多种重要功能［1］。研究发现它与高血压、心肌重构、心力衰竭、心肌缺血及动脉粥样硬化的发生发展密切相关［2－3］。目前，ROCK已成为治疗心血管疾病的新的药物靶点［4－5］。

5-硝基-1（2）氢-吲唑-3腈（简称 DL0805，Fig 1 A）是在前期高通量药物筛选中发现的具有Rho激酶抑制活性的化合物［6］。研究表明［7－8］，DL0805具有良好的舒张血管活性。4-（4-氟苯基）-N-｛5-（1H-吲唑）｝-2-甲基-6-羰基-1，4，5，6，-四氢-3-吡啶甲酰胺（简称DL0805-0，Fig 1 B）与DL0805具有相同的吲唑母核，是DL0805经过结构优化获得的具有Rho激酶抑制活性的化合物，与文献报道一致［9］。本实验采用离体大鼠胸主动脉环张力测定方法，观察DL0805-0对高钾和去甲肾上腺素（noreponephrine，NE）刺激的大鼠胸主动脉环的舒张作用并探讨其可能的作用机制。

Fig 1 Structures of DL0805 and DL0805-0

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器、药品和试剂 NE、乙酰胆碱（acetycholine，ACh）、吲哚美辛、左旋硝基精氨酸甲醋（Nωnitro-L-arginine methyl ester，L-NAME）、亚甲蓝、四乙胺（tetraethyl ammonium，TEA）、格列本脲、4-氨基吡啶（4-aminopyridine，4-AP）、盐酸法舒地尔均购自美国Sigma公司；DL0805-0由中国医学科学院药物研究所谢平教授课题组提供（分子质量：363.37），纯度＞95%（HPLC测定），临用前用二甲基亚砜（DMSO）溶解。MP100A生理信号记录分析系统购自美国BIOPAC公司。

1.1.2 实验动物 SPF级♂ SD大鼠，体质量250～300 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司［合格证编号 SCXK（京）2012－001］。

1.2 方法

1.2.1 大鼠胸主动脉环的制备 断头处死大鼠，迅速取出胸主动脉，置于95%O2和5%CO2混合气预饱和的4℃ Krebs-Henseleit（K-H）液中。洗去残血，仔细剔除血管周围脂肪和结缔组织，避免过度牵拉，将血管条剪成3～4 mm的血管环标本。根据实验需要，去内皮的血管，用棉签轻轻摩擦血管环内表面以去除内皮。小心地将两个不锈钢三角环穿入到血管环中，将一端固定于浴槽底部，另一端连于张力换能器，浴槽中加入8 ml K-H液，维持37℃，充入95%O2和5%CO2的混合气体。调节初始张力为1.2 g，稳定1.5 h，期间换 K-H液1次。用含60 mmol·L-1KCl的高钾K-H液使血管平滑肌去极化，达最大收缩，检测标本的反应性。用K-H液反复冲洗至基线，重新平衡30 min。采用经典的乙酰胆碱内皮鉴定，以确定内皮是否完整或去内皮是否完全。加入终浓度0.1μmol·L－1的NE刺激收缩达到平台期后，加入终浓度1μmol·L－1的 ACh，如果ACh能引起血管舒张达到60%以上则认为内皮完整，如果低于5%则认为内皮己经被完全去除。用K-H液反复冲洗至基线，以进行下一步实验。

1.2.2 DL0805-0对KCl预收缩胸主动脉血管环的舒张作用 内皮完整的血管环，用含60 mmol·L－1KCl的高钾K-H液使血管环收缩并达到稳定后，分别累积加入DL0805-0或法舒地尔，终浓度依次为1、2.5、5、10、20μmol·L－1，溶剂对照组加入相同体积的溶剂（DMSO），每5 min加药1次。以每次加入药物5 min后的血管收缩张力与KCl诱发的血管环的最大收缩张力之间的比值反映血管张力的变化。

1.2.3 DL0805-0对NE预收缩胸主动脉血管环的舒张作用 参照“1.2.2”步骤，加入0.1μmol·L－1的NE预孵育后，分别累积加入DL0805-0或法舒地尔，终浓度依次为0.1、0.2、0.5、1、2.5、5μmol·L－1。

1.2.4 内皮对DL0805-0舒张血管作用的影响 内皮完整的血管环，分别加入一氧化氮合成酶抑制剂L-NAME（100μmol·L－1）、鸟苷酸环化酶抑制剂亚甲蓝（5μmol·L－1）、环氧化酶抑制剂吲哚美辛（5 μmol·L－1），预孵育 20 min。加入 0.1μmol·L－1的NE预孵育，待血管环收缩达到稳定后，分别累积加入 DL0805-0，终浓度依次为 0.1、0.2、0.5、1、2.5、5μmol·L－1，溶剂对照组处理同上，每5 min加药1次。以每次加入药物5 min后的血管收缩张力与NE诱发的血管环的最大收缩张力之间的比值反映血管张力的变化。

1.2.5 钾通道对DL0805-0舒张血管作用的影响内皮去除的血管环，分别加入钙激活钾通道阻滞剂TEA（5 mmol·L－1）、ATP敏感钾通道阻滞剂格列本脲（10μmol·L－1）和电压依赖钾通道阻滞剂4-AP（100μmol·L－1），参照“1.2.4”步骤。

1.2.6 DL0805-0对NE诱导的内钙依赖性收缩的影响 内皮去除的血管环，用含 50μmol·L－1EGTA的K-H液冲洗2次，每次维持10 min，换用不含EGTA的无钙K-H液平衡至基线水平。加入DL0805-0，终浓度分别为 0.1、1、5μmol·L－1，溶剂对照组处理同上。预孵育20 min后，加入1μmol·L－1的NE。以加入NE 15 min后的血管收缩张力与NE诱发的血管环的最大收缩张力之间的比值反映血管张力的变化。

1.2.7 DL0805-0对复钙诱导的外钙依赖性血管收缩的影响 参照“1.2.6”步骤，冲洗后换用含60 mmol·L－1KCl的无钙高钾K-H液平衡至基线水平。不同剂量的DL0805-0预孵育20 min后，累积加入 CaCl2溶液，终浓度依次为 0.1、0.5、1、1.5、2、2.5μmol·L－1，每 5 min加 CaCl2溶液 1次。以每次加入CaCl2溶液5 min后的血管收缩张力与KCl诱发的血管环的最大收缩张力之间的比值反映血管张力的变化。

1.2.8 统计学方法 采用GraphPad Prism 5统计软件进行统计学分析，所有数据均以¯x±s表示，多组间比较用单因素方差分析。

2 结果

2.1 DL0805-0对高浓度KCl预收缩胸主动脉血管环的舒张作用 DL0805-0能够剂量依赖性地抑制高浓度KCl所致的主动脉环收缩，其舒张作用强度与Rho激酶抑制阳性药法舒地尔比较差异无显著性（Fig 2），两者pEC50分别为5.48±0.21和5.25±0.33。

2.2 DL0805-0对NE预收缩胸主动脉血管环的舒张作用 DL0805-0能剂量依赖性的舒张1μmol·L－1NE预收缩的大鼠胸主动脉环，且与法舒地尔的作用差异无显著性。在内皮完整的大鼠胸主动脉环DL0805-0和法舒地尔pEC50分别为6.74±0.34和6.26±0.17，在内皮去除的大鼠胸主动脉环其pEC50分别为6.14±0.11和5.89±0.10。DL0805-0浓度为0.1、0.2、0.5μmol·L－1时对内皮完整血管环的舒张作用明显强于内皮去除的血管环，浓度为1、2.5、5μmol·L－1时舒张作用相似（Fig 3）。

Fig 2 Vasorelaxant effect of DL0805-0 or fasudil on rat thoracic aortic rings contracted by KCl（60 mmol·L－1）.（¯x±s，n＝6）

2.3 内皮对DL0805-0舒张血管作用的影响 LNAME可明显抑制0.2、0.5、1μmol·L－1DL0805-0对NE预收缩血管的舒张作用，而亚甲蓝和吲哚美辛对DL0805-0舒张血管作用无明显影响（Fig 4）。

2.4 钾通道对DL0805-0舒张血管作用的影响TEA可抑制 0.1、0.2、0.5μmol·L－1DL0805-0对NE预收缩血管的舒张作用，而格列本脲和4-AP对DL0805-0的舒张血管作用均无明显影响（Fig 5）。

2.5 DL0805-0对NE诱导的内钙依赖性收缩和复钙诱导的外钙依赖性收缩的影响 1、5μmol·L－1DL0805-0均能够明显抑制NE在无钙K-H液中引起的血管收缩效应（Fig 6A）。1、5μmol·L－1DL0805-0能够明显抑制CaCl2在无钙高钾K-H液中引起的血管收缩效应（Fig 6B）。

3 讨论

生理条件下，高钾可激活平滑肌细胞膜上电压依赖性钙通道，细胞外钙内流，促进血管收缩［10］。NE激活血管平滑肌细胞膜上受体操控性钙通道，促进细胞外钙内流，同时还触发平滑肌细胞肌浆网释放钙离子，使［Ca2＋］i升高，血管收缩［11］。本研究结果显示，DL0805-0能剂量依赖性抑制KCl和NE引起的血管收缩，作用强度类似于阳性药法舒地尔，说明DL0805-0具有明显的舒张血管作用。

内皮通过释放各种血管活性物质如舒张血管活性物质NO、前列环素，以及促进血管收缩的活性物质如内皮素、血管紧张素Ⅱ等［12－13］调节血管张力。去除内皮后，在低浓度下DL0805-0舒张血管的作用明显减弱，提示其舒张血管作用可能部分依赖于内皮的存在。一氧化氮合成酶抑制剂L-NAME和鸟苷酸环化酶抑制剂亚甲蓝分别通过不同途径阻断NO舒张血管的作用，环氧合酶抑制剂吲哚美辛通过抑制前列腺素I2合成，减弱前列环素舒张血管的活性。实验结果显示，L-NAME可明显抑制DL0805-0对NE收缩血管的舒张作用，而亚甲蓝和吲哚美辛无明显影响，表明DL0805-0依赖内皮的舒张血管作用可能与调控NO的合成有关，而与前列腺素I2无关。

Fig 3 Vasorelaxant effect of DL0805-0 or fasudil on rat thoracic aortic rings pre-contracted by NE（10－7 mol·L－1）

Fig 4 Effect of pre-incubation of methylene blue，L-NAME and indomethacin on DL0805-0 induced relaxation in endothelium-intact aorta（¯x±s，n＝6）.

Fig 5 Effect of pre-incubation of TEA，glibenclamide and 4-AP on DL0805-0 induced relaxation in aorta（¯x±s，n＝6）.

K＋通道在调节血管平滑肌作用中占有重要地位，激活血管平滑肌上的K＋通道能引起细胞膜超极化，抑制细胞外钙内流，使血管舒张［10］。结果表明，TEA可抑制低浓度的DL0805-0舒张血管的作用，而格列本脲和4-AP对其舒张血管作用无明显影响，说明DL0805-0的舒张血管作用可能与直接开放血管平滑肌细胞上钙激活的钾离子通道有关。

细胞内钙离子在血管平滑肌细胞的收缩中起着关键的作用。正常情况下，细胞内钙离子浓度较低，细胞“兴奋”时，细胞内钙离子浓度升高，引起细胞收缩。细胞内钙升高主要有两条途径，即细胞外钙内流和细胞内钙释放［11］。本实验结果发现DL0805-0（1、5μmol·L-1）能明显抑制NE在无钙K-H液中引起的血管收缩效应，提示DL0805-0能明显抑制细胞内Ca2＋释放。

Fig 6 Inhibitory effect of DL0805-0 on contraction induced by intracellular Ca2＋ release and extracellular Ca2＋ influx

在无钙高钾K-H液中，伴随着CaCl2的加入，高钾使细胞外Ca2＋经电压依赖性钙通道进入细胞内，导致血管收缩。本实验发现，DL0805-0（1、5μmol·L－1）明显抑制累积加入的CaCl2在无钙高钾K-H液中引起的血管收缩效应，说明DL0805-0能明显抑制细胞外Ca2＋内流。

综上所述，作为一个与DL0805具有相同吲唑母核的新型Rho激酶抑制剂，DL0805-0表现出与阳性药法舒地尔强度相似的舒张血管作用。其舒张血管效应可能部分依赖于血管内皮，同时开放血管平滑肌细胞上钙激活的钾离子通道以及阻滞钙离子通道也是其舒张血管的重要作用机制。提示其具有潜在的治疗高血压等心血管疾病的作用。

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