新型化合物XN4抑制急性粒细胞白血病细胞增殖与其诱导氧化性的DNA损伤的关系

吴丽贤，黄立森，陈显凌，柯 方，郑 鸣，许建华

（1.福建医科大学药学院药理系，福建福州 350004；2.福建省天然药物药理学重点实验室，福建福州 350004；3.福建医科大学药学院药化系，福建福州 350108；4.福建医科大学人体解剖与组织胚胎学系，福建福州 350108；5.福建医科大学附属协和医院血液科，福建福州 350001；6.福建省血液病研究所，福建 福州 350001）

急性髓性白血病（acute myeloid leukemia，AML）［1］是源于造血干细胞的克隆性恶性疾病。以骨髓异常的原始细胞及幼稚细胞大量增殖，抑制正常造血，广泛浸润肝、脾、淋巴结等脏器为主要特征。其起病急、恶性程度高，如得不到及时诊治，生存期短。临床针对AML的治疗，以化疗为主，通过有效的化疗，不少患者病情得以缓解，但AML的复发和耐药问题比较突出［2］，因此继续研发新的抗AML药物，可以提高AML的治愈率和解决AML的复发和耐药问题。

Nov（novobiocin）是香豆素类抗生素的代表药物，本课题组前期研究表明，Nov具有抑制急性粒细胞白血病细胞HL-60的增殖能力，但其活性较低，半数抑制率 IC50为 356.4μmol·L－1［3］，为了提高 Nov的抑制急性粒细胞白血病的活性，本课题组合成了一系列Nov的衍生物，通过体外活性筛选，发现XN4具有明显的抑制AML细胞的增殖，但具体的作用机制不明。因此本课题组致力于通过研究XN4与DNA损伤的关系来探讨其抑制AML增殖的作用机制，为合成活性更强的Nov衍生物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 HL-60细胞和KG1α细胞购置于中科院上海细胞库，按其细胞库参考要求进行培养。XN4由本课题合成和纯化，纯度为0.96，溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，配成储存液 100 mmol·L－1于－20℃备用，使用前解冻，用培养液稀释成所需浓度。RPMI 1640培养基和胎牛血清均购于Hyclone公司。MTT购置于美国Sigma公司，用磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01 mol·L－1，pH值 7.4）稀释成 5 g·L－1存储液，分装 ，－20℃避光储存；r-H2AX、p-ATM、Parp、cleaved Caspase-3、CDK2、Cyclin E1单克隆抗体均购置于Cell Signaling Technology公司 ，βactin单克隆抗体和羊抗鼠、羊抗兔IgG-HRP二抗购于凯基生物公司。ECL Western blot Detection System超强发光底物购置于Signalway Antibody公司。BCA蛋白定量试剂盒和流式凋亡检测试剂盒均购自瑞士Roche公司。RNA酶和碘化丙啶（PI）购于美国Sigma公司。NAC和ROS检测试剂盒购置于碧云天公司。Image station 4000MM成像系统购于柯达公司；BD FACSCantoⅡ流式细胞仪购于BD公司，电泳、转膜仪为BIORAD公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 AML细胞采用含10%的胎牛血清 RPMI 1640，青霉素（100 000 IU·L－1）和链霉素（50 mg·L－1），在 37℃、5%的 CO2孵育箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 XN4对AML细胞增殖的抑制作用 收集对数期生长的AML细胞，按每孔10 000个细胞体积为200μl种植于96孔培养板，不同浓度的XN4处理48 h，并设置对照组（不加药物），空白组（只加培养基，无细胞），每组设3个副孔，48 h后每孔加入5 g·L－1的MTT溶液20μl，继续培养4 h，800×g离心5 min，弃上清，加入150μl DMSO振荡10 min，用全自动酶标仪（Therm公司）检测570 nm处的吸光度（OD）值，结果采用GraphPad Prism 5软件分析，并绘制相应的抑制率－对数浓度曲线，计算药物的IC50。

1.2.3 XN4对AML细胞内ROS的影响 通过使用氧化敏感的荧光探针（DCFH-DA）检测细胞内ROS的水平［4］。不同浓度的XN4处理细胞24 h，5 mmol·L－1NAC预先处理AML细胞1 h再加上6 μmol·L－1XN4处理24 h。收集细胞，用 PBS洗涤两次，37℃下用10μmol·L－1的 DCFH-DA孵育细胞20 min（根据产品说明）。DCFH-DA被细胞内的非特异性酯酶脱去乙酰基，被ROS氧化成荧光性化合物DCF，流式细胞仪检测DCF荧光强度。

1.2.4 XN4对AML细胞内DNA损伤的影响 取对数生长期AML细胞，10μmol·L－1的 BrdU预处理30 min，不同浓度的XN4处理细胞24 h，5 mmol·L－1NAC预先处理AML细胞1 h再加上6μmol·L－1XN4处理24 h，收集细胞，以800×g离心5分钟，弃上清，破膜，DNase处理 1 h，anti-BrdU，anti-H2AX，anti-cleaved parp荧光探针室温孵育20 min，按试剂盒说明操作。转入到流式管中，上机检测。

1.2.5 XN4对AML细胞凋亡的影响 取对数生长期的AML细胞，不同浓度的XN4处理细胞24 h，5 mmol·L－1NAC预先处理AML细胞1 h再加上6 μmol·L－1XN4处理48 h，收集细胞，800×g离心 5 min，冷PBS重悬洗涤细胞两次，用500μl含有分别含有5μl Annxin V-FITC和5μl PI的Binding buffer重悬混匀细胞，室温避光孵育15 min，转移入流式管中，流式细胞仪上机检测。

1.2.6 XN4对AML细胞周期的影响 取对数生长期的AML细胞，不同浓度的XN4处理细胞，5 mmol·L－1NAC预先处理AML细胞1 h再加上6μmol·L－1XN4，37℃培养 48 h；收集细胞，800×g离心 5 min；用冷的PBS重悬洗涤细胞1次，再用0.5 ml冷PBS重悬细胞，并将其缓慢的滴加4.5ml预冷75%乙醇中，－20℃冰箱中放置过夜；800×g离心5 min，弃去乙醇，用PBS洗涤1次，用0.5 ml含有50 mg·L－1RNA酶和50 mg·L－1碘化丙啶的 PBS重悬细胞，室温避光孵育30 min，流式细胞仪上机检测。实验结果采用Modifit软件进行分析。

1.2.7 XN4对AML细胞内蛋白表达的影响 取对数生长期的AML细胞，不同浓度的XN4处理48 h，收集裂解细胞，蛋白定量，98℃蛋白变性，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜，封闭，相应一抗过夜孵育，TBST洗涤3次，每次10 min，室温下二抗孵育1 h，TBST洗涤3次，每次10 min，用 ECL Western blot Detection System超强发光底物在Image station 4000MM成像系统进行曝光显影。

1.2.8 统计学分析 实验数据采用¯x±s表示，实验独立重复3次，采用One-Way analysis of variance统计分析。

2 结果

2.1 XN4抑制AML细胞的增殖 不同浓度的XN4处理AML细胞48h后，MTT法检测，结果采用GraphPad Prism 5软件分析见（Fig 1），随着药物浓度的增加，XN4抑制HL-60和KG1α细胞增殖的能力逐渐增强，IC50分别为（2.79±0.15）μmol·L－1和（2.76±0.20）μmol·L－1，见 Fig 1。

Fig 1 Proliferation inhibition of AML with XN4 treatments（¯x±s，n＝3）

2.2 XN4明显增加AML细胞内ROS水平 ROS能够氧化DCFH-DA成荧光性化合物DCF，因此检测DCF的荧光强度可以间接反映ROS的水平［5］。不同浓度的XN4处理AML细胞24 h后，ROS检测表明XN4能明显增加AML细胞内ROS的水平，5 mmol·L－1NAC预先处理AML细胞1 h能逆转XN4诱导的ROS的增加（Fig 2）。

2.3 XN4诱导AML细胞DNA的损伤 r-H2AX是DNA损伤的一个灵敏性标志物，在DNA损伤时，其会聚集在 DNA损伤处形成焦点（Foci）［6］，招募DNA损伤应答的相关蛋白。本实验的结果表明XN4能明显增加AML细胞中r-H2AX的表达，而5 mmol·L－1NAC预先处理1 h能逆转 XN4对 r-H2AX的改变（Fig 3）。

Fig 2 Effect of Nov on intracellular ROSwith XN4 treatments（x¯±s，n＝3）1：Control；2：XN4 1.5μmol·L－1；3：XN4 3μmol·L－1；4：XN4 6μmol·L－1；5：NAC 5 mmol·L－1；6：NAC 5 mmol·L－1＋XN4 6μmol·L－1Fig 2 Demonstrates that XN4 could significantly increase the level of intracellular ROS，5mmol·L－1NACpre-treating AML for 1h could reverse this effect.**P＜0.01 vs control group.

Fig 3 XN4 induced DNA damage to AML cells（¯x±s，n＝3）1：Control；2：XN4 1.5μmol·L－1；3：XN4 3μmol·L－1；4：XN4 6μmol·L－1；5：NAC 5 mmol·L－1；6：NAC 5 mmol·L－1＋XN4 6μmol·L－1Fig 3 obviously shows that XN4 could increase the level of r-H2AX，5mmol·L－1 NAC pre-treating AML for 1h could decrease this effect.**P＜0.01 vs control group.

2.4 XN4增加AML细胞周期凋亡 不同浓度的XN4处理 AML细胞48 h，PI和 Annexin V-FITC双染［7］流式细胞术检测细胞凋亡结果表明，XN4能够明显增加细胞的凋亡率，当预先采用5 mmol·L－1NAC处理细胞1 h，XN4诱导细胞的凋亡作用明显减弱（Fig 4）。

2.5 XN4诱导AML细胞周期S期阻滞 不同浓度的XN4处理AML细胞24和48h，PI染色流式细胞术检测细胞周期，结果表明随着XN4药物浓度的增加，处于细胞周期S期细胞比例明显增加，细胞周期阻滞在S期（Fig 5）。

2.6 XN4对AML蛋白表达的影响 不同浓度的XN4处理AML细胞48 h，蛋白免疫印迹结果表明XN4能明显增加r-H2AX、ATM的表达以及Parp和Caspase-3的切割，而降低CDK2和Cyclin E1的表达（Fig 6）。

3 讨论

AML是白血病的主要类型，具有起病急、恶性程度高、好发于成人和儿童［8］。临床常用化学药物疗法如阿糖胞酐、环磷酰胺、长春新碱、柔红霉素等，这些药物虽然疗效尚可，但毒副作用大。

Nov作为一种抗生素也具有体外抗HL-60细胞及毒性低的优点，但活性低，IC50大。本课题组合成的新生霉素衍生物XN4在体外也表现出明显的抗AML细胞增殖的作用，并较其母药活性提高了近100多倍。本课题组通过前期对Nov的研究，表明Nov通过激活细胞内ROS，诱导DNA的损伤，从而发挥抑制慢性粒细胞白血病K562和K562／G01的增殖作用。

Fig 4 XN4 increases the apoptosis ratio of AML cells（¯x±s，n＝3）1：Contol；2：XN4 1.5μmol·L－1；3：XN4 3μmol·L－1；4：XN4 6μmol·L－1；5：NAC 5 mmol·L－1；6：NAC 5 mmol·L－1＋XN4 6μmol·L－1.PI and Annexin v-FITCdouble staining were used to examine the effect of XN4 on cell apoptosis.The data shows that XN4 could increase the apoptotic ratio of AML cells after XN4 treatment for 48h.5mmol·L－1NACpre-treating AML for 1h could decrease this effect.**P＜0.01 vs control group.

Fig 5 XN4 induced AML cell cycle S phase arrest

Fig 6 XN4 influences the intracellular proteins expression

ROS是细胞内反应性氧自由基，如超氧阴离子自由基、羟自由基、过氧化氢等［9］，外环境的理化因素、化疗药物和细胞自身的代谢会导致ROS的激活，激活的ROS具有破坏生物体细胞膜和重要细胞器的结构和功能，如破坏线粒体，断绝细胞的能源；毁坏溶酶体，使细胞自溶；损伤DNA，导致基因突变和细胞凋亡［10］。H2AX是维持 DNA结构的组蛋白，在 DNA损伤时能够磷酸化成 r-H2AX，招募DNA损伤修复应答相关蛋白，在DNA断裂处形成焦点（Foci），因此r-H2AX成为检测DNA损伤的一个灵敏的标志物（biomarker）［11］，Parp是执行 DNA损伤修复的一个重要功能蛋白，被切割成Cleaved Parp时失活。本实验结果表明XN4能够激活细胞内ROS，增加H2AX的磷酸化水平，诱导DNA的损伤；并且XN4能够促进Parp的切割，抑制DNA的损伤修复，而抗氧化剂NAC能够通过抑制ROS的激活，逆转XN4诱导DNA损伤。

众所周知，细胞本身具有应对DNA损伤修复的能力［12］，当感知DNA损伤时，激活DNA损伤应答反应，诱导细胞周期阻滞，为DNA损伤修复提供时间；诱导细胞凋亡，清除损伤细胞。CDK2和Cyclin E1是维持细胞周期S期向 G2／M转换的重要分子［13］，表达减少影响细胞周期进程，细胞阻滞于S期。Caspase-3是细胞凋亡级联反应的重要分子，被切割而活化，执行细胞程序化死亡功能。XN4通过抑制CDK2和Cyclin E1的表达水平，使细胞阻滞在S期，并且通过增加Caspase-3的切割，促进细胞的凋亡。

4 结论

XN4通过激活ROS，诱导HL-60及KG1α细胞DNA的损伤，抑制CDK2和Cyclin E1的表达诱导细胞S期阻滞期增殖，促进Parp和Caspase-3的切割，抑制DNA损伤修复功能和诱导细胞凋亡，从而抑制AML细胞增殖。

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