地西泮对体外大鼠心肌生理特性和动作电位的影响*

李璠璠，李杰，王嘉陵，肖军花

(华中科技大学同济医学院基础医学院药理学系，武汉 430030)

地西泮对体外大鼠心肌生理特性和动作电位的影响*

李璠璠，李杰，王嘉陵，肖军花

(华中科技大学同济医学院基础医学院药理学系，武汉 430030)

目的研究地西泮对体外大鼠心肌生理特性和动作电位的影响。方法采用常规体外器官实验法记录右心房自搏频率、心肌收缩力、功能性不应期和兴奋性;标准玻璃微电极细胞内记录技术记录心室乳头肌细胞动作电位。结果0.017 5～5.25μmol·L-1地西泮对右心房自搏频率影响不明显,17.5～175.0μmol·L-1可浓度依赖性地降低自搏频率,可致部分标本停搏;地西泮低浓度时降低体外心肌收缩力,高浓度时心肌收缩力恢复甚至增强;0.175μmol·L-1地西泮可延长左心房功能性不应期;17.5μmol·L-1地西泮可使左心房兴奋性曲线右移;17.5μmol·L-1地西泮不影响静息电位、动作电位时程,可明显降低动作电位振幅。结论地西泮直接影响心肌自搏频率、收缩力、功能性不应期和兴奋性等特性及动作电位振幅。

地西泮；心肌；生理特性；动作电位

地西泮作为苯二氮 类镇静催眠药的典型代表药,在世界范围内被广泛应用,其有效性及安全性被大众接受。在临床上,很多心血管疾病如心肌缺血、心律失常、高血压等,常联合应用地西泮治疗,疗效确切［1-4］。其机制通常认为是通过其抗焦虑等中枢作用发挥辅助治疗功效。然而,近年来有研究表明,地西泮还具有明显的心血管作用,如抗大鼠缺血性心律失常［5］等,但地西泮对体外心肌生理特性作用笔者尚未见报道。因此,笔者在本研究系统研究地西泮对体外大鼠心肌自律性、收缩性、兴奋性、功能不应期及乳头肌动作电位的作用。

1 材料与方法

1.1 动物与药品 成年健康SD大鼠,体质量(250± 25)g,雌雄不拘,清洁级,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供,许可证号为SCXK(鄂)20100010。地西泮购自天津金耀氨基酸有限公司,批号:1105081。其他常用试剂均为国产分析纯。

1.2 体外心肌生理特性 取大鼠,击头致昏,开胸,迅速取出心脏,制备带有窦房结的右心房及左心房标本,分别悬吊于盛有K-H液(氯化钠6.92 g·L-1,氯化钾0. 35 g·L-1,氯化钙0.28 g·L-1,磷酸二氢钾0.16 g·L-1,七水硫酸镁0.29 g·L-1,碳酸氢钠2.1 g·L-1,葡萄糖2.0 g·L-1,pH 7.3～7.4)的器官浴槽内,温度(36.0±0.5)℃,连续通入95%氧气(O2)和5%二氧化碳(CO2)混合气体,心房标本的静息张力调整到1 g,平衡1～1.5 h,测以下4种心肌生理特性。

1.2.1 右心房自搏频率 收缩信号经肌张力换能器输入RM6240多道生理信号采集处理系统(成都仪器厂),记录给药前右心房自搏频率,每隔10 min按半对数摩尔浓度累积方式给予地西泮至浴槽内,观察其对右心房自搏频率的影响。

1.2.2 左右心房肌收缩力 给予波宽2 ms、频率2 Hz、比阈电压高0.5倍的方波连续刺激标本,引发收缩,记录正常收缩力,每隔10 min按半对数摩尔浓度累积方式给予地西泮至浴槽内,观察其对心肌收缩力的影响。

1.2.3 左心房肌功能性不应期(functional refractory period,FRP)给予波宽2 ms、频率2 Hz、5倍于阈电压、波幅相等的两次超强刺激,记录两脉冲均可引起收缩的最小间隔时间,即FRP,每隔10 min依次给予0.175,1.75,17.5μmol·L-1地西泮至浴槽内,观察其对FRP的影响。

1.2.4 左心房肌兴奋性 用频率1 Hz,波宽分别为0.2,0.5,1,3,5,10 ms的方波刺激左心房,测定心肌刚好出现收缩时的刺激电压强度,即阈电位,每隔10 min依次加入0.175,1.75,17.5μmol·L-1地西泮至浴槽内,观察其对心肌兴奋性的影响。

1.3 心室乳头肌动作电位 击大鼠头致昏迷,迅速开胸取出心脏,置入预先经95%O2和5%CO2混合气饱和的温K-H液中,制备乳头肌标本,水平固定于恒温浴槽内,温度(36.0±0.5)℃,连续通入95%O2和5% CO2混合气体,K-H液循环灌流标本。乳头肌由计算机直接输出频率1 Hz,波宽3 ms,1.5倍阈电压刺激,用标准玻璃微电极技术引出心肌细胞动作电位,经微电极放大器(SWF-2W,成都仪器厂)放大,信号输入计算机实时记录快反应动作电位。待引出的动作电位稳定30 min后,每隔10 min依次加入0.175,1.75, 17.5μmol·L-1地西泮至浴槽内,观察给药前后动作电位的变化。

2 结果

2.1 地西泮对右心房自搏频率的作用 当地西泮浓度达17.5,52.5,87.5和175.0μmol·L-1时,可使部分右心房骤然停搏,累积停搏率分别为5.56% (1/18),16.67%(3/18),27.78%(5/18)和77.78% (14/18)。统计分析未停搏的11只右心房自搏频率结果见图1,地西泮终浓度为0.017 5,0.052 5,0.175, 0.525,1.75,5.25μmol·L-1时,对体外大鼠右心房自搏频率无明显影响；高浓度地西泮可明显降低右心房自搏频率,并呈现浓度依赖性。

图1 地西泮作用后对大鼠体外右心房自搏频率影响与0μmol·L-1比较,*1P<0.05Fig.1 Effect of diazepamon spontaneous beats of isolated rat right atriumCompared with 0μmol·L-1diazepam,*1P<0.05

2.2 地西泮对体外大鼠左心房兴奋性的影响 用频率1 Hz,波宽分别为0.2,0.5,1,3,5,10 ms的方波刺激左心房,测定阈电位,绘制出波宽-阈电位的兴奋性曲线。见表1。0.175,1.75μmol·L-1地西泮不明显影响左心房的兴奋性曲线,而17.5μmol·L-1地西泮可使左心房兴奋性曲线右移,降低左心房的兴奋性。

表1 不同浓度地西泮在不同波度下对体外大鼠左心房兴奋性阈电压的影响Tab.1 Effect of different concentration of diazepamon the excitability of isolated rat left atriumdifferent wave-width V,±s

表1 不同浓度地西泮在不同波度下对体外大鼠左心房兴奋性阈电压的影响Tab.1 Effect of different concentration of diazepamon the excitability of isolated rat left atriumdifferent wave-width V,±s

与0μmol·L-1比较,*1P<0.05Compared with 0μmol·L-1diazepam,*1P<0.05

地西泮浓度/ (μmol·L-1)0.2 ms 0.5ms 1 ms 3ms 5ms 10ms 0.0 2.445±1.421 1.581±0.957 1.272±0.748 1.061±0.646 1.008±0.641 0.956±0.633 0.175 2.419±1.425 1.538±0.962 1.254±0.758 1.074±0.655 1.034±0.660 0.996±0.666 1.75 2.434±1.461 1.578±0.985 1.288±0.791 1.106±0.691 1.061±0.692 1.035±0.705 17.5 2.788±1.759 1.797±1.189 1.455±0.946 1.266±0.829*11.233±0.834*11.206±0.847*1

2.3 地西泮对体外心肌收缩力的影响 地西泮终浓度为0.017 5,0.052 5,0.175,0.525,1.75,5.25, 17.5μmol·L-1时,可浓度依赖性地降低体外大鼠右心房心肌收缩力。但当地西泮浓度进一步增加达52.5,175.0μmol·L-1时,体外大鼠右心房心肌收缩力不减弱,反而有上升趋势。

地西泮浓度为0.017 5,0.052 5,0.175,0.525, 1.75,5.25,17.5μmol·L-1时,对体外大鼠左心房心肌收缩力呈抑制趋势,但是差异无统计学意义(P> 0.05)；当浓度达52.5,175.0μmol·L-1时,呈抑制趋势的左心房心肌收缩力依浓度又恢复至给药前水平。但当地西泮浓度为175.0μmol·L-1时,可使刺激诱导收缩的7只体外左心房停跳,停搏率达46.67%。统计分析未停搏的心肌收缩力变化见表2。

表2 地西泮对离体大鼠左右心房心肌收缩力的作用Tab.2 Effect of diazepamon contractile force of isolated rat right and left atriumof rats g,±s

表2 地西泮对离体大鼠左右心房心肌收缩力的作用Tab.2 Effect of diazepamon contractile force of isolated rat right and left atriumof rats g,±s

与0.0μmol·L-1地西泮比较,*1P<0.05;与0.175μmol·L-1地西泮比较,*2P<0.05Compared with 0.0μmol·L-1diazepam,*1P<0.05; compared with 0.175μmol·L-1diazepam,*2P<0.05

浓度/ (μmol·L-1)右心房(n＝10)左心房( n＝8) 0.0 0.206±0.104 0.251±0.166 0.017 5 0.198±0.103 0.261±0.154 0.052 5 0.186±0.105 0.252±0.136 0.175 0.196±0.114 0.253±0.138 0.525 0.172±0.095*1*20.229±0.118 1.75 0.174±0.097*1*20.209±0.106 5.25 0.170±0.098*1*20.205±0.098 17.5 0.167±0.099*1*20.204±0.095 52.5 0.202±0.147 0.239±0.135 175.0 0.237±0.183 0.252±0.164

2.4 地西泮对左心房FRP的影响 地西泮浓度为0.175μmol·L-1时,可明显延长左心房FRP；当浓度继续增加为1.75,17.5μmol·L-1,则对左心房FRP无明显影响,见图2。

2.5 地西泮对体外大鼠乳头肌快反应动作电位的影响 0.175,1.75,17.5μmol·L-1地西泮对体外大鼠乳头肌快反应动作电位的静息电位、动作电位时程作用不明显；17.5μmol·L-1地西泮可明显降低动作电位振幅(APA)(图3),冲洗后,APA可部分恢复。

3 讨论

图2 地西泮对大鼠体外左心房功能性不应期的影响与0.0μmol·L-1地西泮比较,*1P<0.05Fig.2 Effect of diazepamon functional refractory period (FRP)of isolated rat left atriumCompared with 0.0μmol·L-1diazepam,*1P<0.05

图3 地西泮对体外大鼠乳头肌动作电位幅度的影响与0.0μmol·L-1地西泮比较,*1P<0.05Fig.3 Effect of diazepamon action potential amplitude (APA)of isolated rat papillary musclesCompared with 0.0μmol·L-1diazepam,*1P<0.05

地西泮药理作用以抗焦虑和镇静催眠作用为主［6］。临床报道地西泮可用于治疗心肌梗死和心律失常［4-5］。以往认为这与其强大的镇静作用从而降低耗氧量、改善心肌供血有关。本研究证明,地西泮对体外大鼠心肌有直接作用。当地西泮浓度达17.5,52.5,87.5和175.0μmol·L-1时,可使部分右心房标本骤然停搏,累积停搏率分别为5.56%,16.67%,27.78%和77.78%。对未停搏的11只标本观察发现,累积终浓度达到52.5 μmol·L-1时地西泮开始对自搏频率表现出显著的抑制效应(P<0.05)。地西泮对体外心房心肌收缩力有直接影响。地西泮低浓度时降低左、右心房心肌收缩力,且具有浓度依赖性。累积终浓度达到0.525μmol·L-1时右心房收缩力开始有显著降低,由给药前的(0.206±0.104)g降为(0.172±0.095)g。随着浓度继续升高,心肌收缩力持续下降,在终浓度为17.5μmol·L-1时收缩力降至最低,为(0.167± 0.099)g。继续增加地西泮浓度时,收缩力不再降低,反而略有上升,分别升至终浓度为52.5μmol·L-1时的(0.202±0.147)g和终浓度为175.0μmol·L-1时的(0.237±0.183)g。地西泮对左心房的心肌收缩力影响差异无统计学意义,但总体趋势与对右心房的影响相同,即在一定的浓度范围(0.175～17.5μmol·L-1)抑制心肌收缩力,浓度继续增加时收缩力不降反升。但当地西泮浓度为175.0μmol·L-1时,可使刺激诱导收缩的7只体外左心房停跳,停搏率达46.67%。据此认为地西泮在特定的浓度范围对心肌收缩力呈现抑制效应,可减轻心肌耗氧量,对心肌细胞有保护作用。

分别给予左心房肌标本0.2,0.5,1,3,5,10 ms的刺激时,阈刺激强度与给药前相比均有升高趋势,但只有在地西泮浓度为17.5μmol·L-1时,在3,5,10ms波宽下,阈刺激强度与给药前相比差异有统计学意义(P<0.05)。据此认为地西泮应用于心血管疾病的安全性比较高,小剂量地西泮对心脏影响小,基本无副作用,可通过作用于大脑边缘系统发挥其抗焦虑作用,改善紧张、忧虑、激动和失眠等症状。研究证明小剂量地西泮短期应用既发挥抗焦虑作用又不会产生依赖。较大剂量地西泮对心脏有抑制效应,可降低心率及心肌收缩力,从而减少心肌耗氧量,对心肌梗死及心律失常有一定的保护作用,尤其对冠心病、高血压和儿茶酚胺引起的快速性心律失常更为有效。

实验还发现,低浓度的地西泮(0.175μmol·L-1)可延长左心房功能性不应期,中、高浓度地西泮(1.75, 17.5μmol·L-1)对左房功能性不应期无显著影响,可见低浓度的地西泮对心肌细胞亦有一定的保护作用,通过延长功能性不应期,促进心脏的收缩和舒张交替进行,有利于心室的充盈和射血。APA随地西泮浓度升高呈下降趋势,在17.5μmol·L-1浓度下APA显著降低,体现高浓度的地西泮对心脏有较明显的抑制作用。实验条件下,地西泮不影响乳头肌快反应动作电位的动作电位时程及静息电位。

已有研究表明,脑内有地西泮高亲和力的特异结合位点苯二氮 受体［7］。其分布以皮质为最密,其次为边缘系统和中脑,再次为脑干和脊髓。这种分布状况与中枢抑制性递质γ-氨基丁酸(gamma-amino butyric acid, GABA)的受体分布基本一致。电生理实验证明,苯二氮类能增强GABA能神经传递功能和突触抑制效应；还有增强GABA与GABA受体相结合的作用。GABA受体是氯离子(Cl-)通道的门控受体,由两个α和两个β亚单位构成Cl-通道。β亚单位上有GABA受点,当GABA与之结合时,Cl-通道开放,Cl-内流,使神经细胞超复极,产生抑制效应。在α亚单位上则有苯二氮 受体,苯二氮 与之结合时,并不能使Cl-通道开放,但它通过促进GABA与GABA受体的结合而使Cl-通道开放的频率增加,更多的Cl-内流。本实验证明地西泮对心肌有直接作用,推测心肌细胞上可能亦存在有Cl-通道,地西泮促进Cl-内流,使心肌细胞超复极,最大复极电位水平绝对值增大,离阈电位远,自动除极化达阈电位的时间延长,自律性降低。目前,全细胞水平的Cl-电流共有7种［6］:由环磷酸腺苷-蛋白激酶A(PKA)所激活的Cl-电流(ICl.PKA)；蛋白激酶C(PKC)所激活的Cl-电流(ICl.PKC)；由嘌呤受体(细胞外ATP等)激活的氯离子电流(ICl.ATP)；由细胞内钙激活的Cl-电流(ICl.Ca)；由细胞肿胀所激活的外向Cl-电流(ICl.swell)；背景基础外向氯离子电流(ICl.b)；由超极化和细胞肿胀所激活的内向整流性Cl-电流(ICl.ir)。地西泮对心肌标本收缩力、兴奋性、及动作电位幅度均有不同程度的抑制作用,一定浓度的地西泮还可延长左房功能性不应期,推测应与这些氯离子电流有关,但本实验尚不能解释具体是哪种或几种Cl-电流在起作用,还需进一步研究。

［1］蒋智勇.小剂量地西泮治疗冠心病心绞痛疗效观察[J].吉林医学,2012,32(21):3483.

［2］孙影,周淑平.冠心病合并室性早搏应用美托洛尔联合小剂量地西泮疗效观察[J].吉林医学,2011,31(36):7702-7703.

［3］杨文玉.地西泮临床应用现状[J].临床医药实践,2009, 18(1):6-7.

［4］李雪梅,常保生,胡惠宁.地西泮在急性心肌梗死中的应用及临床观察[J].西北药学杂志,2007,22(4):202-203.

［5］应康,杨玉梅,徐继辉,等.地西泮抗麻醉大鼠缺血性心律失常的作用[J].包头医学院学报,2002,18(2):89-90.

［6］刘耕陶.当代药理学[M].2版.北京:中国协和医科大学出版社,2008:2.

［7］喻东山.苯二氮 类药物的作用谱[J].医药导报,2010, 29(1):70-74.

DOI 10.3870/yydb.2014.02.005

Effect of Diazepamon Myocardial Physiological Properties and Action Potentials of Rat

LI Fan-Fan,LI Jie,WANG Jia-ling,XIAO Jun-hua
(Department of Pharmacology,Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China)

Objective To study the effects of diazepamonmyocardial physiological properties and action potential in rats.MethodsThe spontaneous beats,contractile force,functional refractory period and excitability of isolated atrialmuscles were recorded according to the regularmethods.Standard microelectrode intracellular recording technique was used to record the action potential of ventricular papillarymuscles.ResultsDiazepam(0.017 5-5.25μmol·L-1)did notmarkedly affect spontaneous beats of the right atrium.Diazepam(17.5-175.0μmol·L-1)reduced the frequency of spontaneous beats in a concentration-dependentmanner.Diazepamat the low dose(0.175μmol·L-1)extended the functional refractory period of the isolated left atrium.Diazepamat the high dose(17.5μmol·L-1)decreased the excitability of left atriumand significantly reduce the action potential amplitude.ConclusionDiazepamexerts direct effectsonmyocardial spontaneousbeats,contractile force,functional refractory period,excitability and action potential.

Diazepam;Myocardium;Physiological properties;Action potential

R971.3;R965

A

1004-0781(2014)02-0152-04

2013-05-02

2013-08-07

*中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(2011TS071)；华中科技大学2010年第一批大学生创业创新基金资助项目(0109510802)。

李璠璠(1988-),女,湖北枣阳人,在读硕士,研究方向:围产医学。电话:(0)15872421509,E-mail：845869565@qq.com。

肖军花(1975-),女,湖北荆门人,副教授,硕士生导师,研究方向:心血管药理。电话:027-83657736,E-mail：xiaoj@mail.hust.edu.cn。