高效液相色谱法测定人血浆中去铁酮含量*

陆华，程道海，雷小光，何云燕，万瑞融，苏明，吴克婕，罗建明

(广西医科大学第一附属医院 1．药学部；2．儿科，南宁 530021；3．桂林医学院药学本科2009级，桂林 541004)

高效液相色谱法测定人血浆中去铁酮含量*

陆华1，程道海1，雷小光1，何云燕2，万瑞融1，苏明1，吴克婕3，罗建明2

(广西医科大学第一附属医院 1．药学部；2．儿科，南宁 530021；3．桂林医学院药学本科2009级，桂林 541004)

目的建立高效液相色谱法测定人血浆中去铁酮(DFP)含量。方法Kromasil C18色谱柱(4.6 mm× 200 mm,5μm),流动相:乙腈-50 mmol·L-1磷酸二氢钾(含5 mmol·L-1庚烷磺酸钠,1%三乙胺)＝11∶89(用磷酸调至pH1.3),检测波长:278 nm,柱温:25℃,进样量:20μL,流速:1mL·min-1。结果DFP在0.5～80.0 mg·L-1浓度范围内线性良好(r＝0.996 5),最低检出浓度为0.5 mg·L-1。高、中、低3种浓度样品绝对回收率>85.6%,方法回收率>89.9%,日内精密度RSD在1.61%～3.70%,日间精密度RSD在1.84%～4.81%。结论该方法操作简便易行,快速准确,灵敏度高,专属性强,适用于DFP的人体血浆浓度测定。

去铁酮；人体血浆；色谱法,高效液相；含量测定

去铁酮(deferiprone,DFP),化学名称3-羟基-1,2-二甲基-4-(1H)-吡啶酮(3-hydroxy-1,2-dimethylpyridin-4(1H)-one),分子式:C7H9NO2,为口服的二齿状金属螯合剂,临床上常用于治疗耐受或不愿意接受现有螯合剂治疗的铁负荷过多的β地中海贫血［1］。β地中海贫血为广西常见的儿童遗传性血液病,临床上表现为慢性血管外溶血,重型死于贫血及含铁血黄素沉着症［2］。因此有必要通过检测患儿体内去铁酮血药浓度来指导临床合理用药。目前,国内文献只有采用高效液相色谱法测定动物血浆中DFP含量的报道［3-6］,笔者尚未见有关建立人体血浆的DFP含量测定方法的报道。本实验建立适用于人体血浆DFP药物浓度检测的高效液相色谱-紫外检测法,方法具有操作简便、快速准确、灵敏度高、专属性强的特点,并在服药患者身上得到验证。

1 试药与仪器

1.1 试药 DFP对照品(海南希源化工科技有限公司,批号:1101002,规格:5 g,含量99.1%)；内标物:替硝唑(中国食品药品检定研究院,批号:100336-200402,纯度:100%)；健康人空白血浆(南宁市中心血站)；乙腈(色谱纯,天津市永大化学试剂开发中心)；磷酸二氢钾(分析纯,成都市科龙化工试剂厂)；庚烷磺酸钠(分析纯,天津市大茂化学试剂厂)；三乙胺(分析纯,成都市科龙化工试剂厂)；磷酸(分析纯,汕头市光华化学厂)。硫酸锌(分析纯,广州化学试剂厂)；甲醇(色谱纯,天津市大茂化学试剂厂)。

1.2 仪器 LC-10ATvp高效液相色谱仪(日本岛津公司)；SPD-6AV UV-VIS检测器(日本岛津公司)；N2000双通道色谱工作站(浙江大学智达信息工程有限公司)；DF110电子分析天平(江苏常熟衡器厂)；PHS-3C精密pH计(上海雷磁仪器厂)；XW-80A涡旋混合器(上海医科大学仪器厂)；H.H.S电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂)；TDXFLX75003530/02高速离心机(美国雅培公司)；TF-50溶剂过滤器(天津市津腾实验设备有限公司)；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；SB2200超声仪(上海BRANSON公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Kromasil C18柱(4.6 mm× 200 mm,5μm)；流动相:乙腈-50 mmol·L-1磷酸二氢钾(含5 mmol·L-1庚烷磺酸钠、1%三乙胺)＝11∶89 (用磷酸调pH至1.30)；检测波长278 nm；柱温25℃；进样体积20μL；流速1.0 mL·min-1。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照溶液制备 精密称取DFP对照品(含量99.1%)0.100 6 g置于50 mL量瓶,用去离子水溶解并稀释至刻度,配制成浓度为1 994 mg·L-1的DFP对照品储备液。配制成的溶液置4℃冰箱保存备用。

2.2.2 内标溶液制备 精密称取内标物替硝唑0.008 4 g置于5 mL量瓶,用去离子水溶解并稀释至刻度,配制成浓度为1 680 mg·L-1的替硝唑内标溶液。配制成的溶液置4℃冰箱保存备用。

2.2.3 沉淀剂制备 称取硫酸锌30.0 g于100 mL量瓶,用去离子水溶解并稀释至刻度,配制成30%硫酸锌溶液作沉淀剂。配制成的溶液置4℃冰箱保存备用。

2.3 血样处理 取血浆425μL,加内标储备液25μL,混匀后加入沉淀剂50μL,置于1.5 mL离心管,涡旋振摇1 min,置50℃水浴锅中保温10 min,冷却,10 900 r·min-1离心5 min,取上清液按“2.1”项进样,记录色谱图。

2.4 方法验证 取DFP对照溶液和内标溶液各25μL,加适量纯化水混匀,配制成A液500μL；取DFP对照溶液、内标溶液各25μL,沉淀剂50μL,加适量纯化水混匀,配制成B液500μL；取沉淀剂50μL,加适量健康人空白血浆混匀,配制成C液500μL；取DFP对照溶液、内标溶液各25μL,沉淀剂50μL,加适量健康人空白血浆混匀,配制成D液500μL。A、B、C、D液按“2.3”项的“涡旋振摇1 min,置50℃水浴锅中保温10 min,冷却,10 900 r·min-1离心5 min,取上清液按“2.1”项进样得色谱图(图1)。结果图1A显示DFP和内标在该色谱条件下峰形良好,能有效分离,保留时间控制在10 min内；图1C,图1D显示血浆中成分对DFP和内标测定无干扰；比较图1A、图1B的DFP的峰面积,以及与内标峰面积进行比值,无明显差异,说明加入的沉淀剂(30%硫酸锌)对含量测定结果无干扰。

图1 DFP高效液相色谱图A.纯化水加DFP、内标(替硝唑);B.纯化水加DFP、内标、沉淀剂;C.空白血浆加沉淀剂;D.空白血浆加DFP、内标、沉淀剂;1.DFP;2.替硝唑Fig.1 HPLC Ch romatogramof DeferiproneA.distilled water spiked with deferiprone and reference substance(tinidazole);B.distilled water spiked with deferiprone、reference substance and precipitant;C.blank plasma spiked with precipitant;D.blank plasma spiked with deferiprone、reference substance and precipitant;1.deferiprone;2.tinidazole

2.5 标准曲线制备 按“2.3”项操作取DFP对照品储备液(浓度为1 994 mg·L-1),用健康人空白血浆稀释成含0.5,1.0,2.0,5.0,10.0,20.0,40.0,80.0 mg·L-1的各系列浓度,进样并记录DFP和内标峰面积,并将其比值(Y)与各对应的DFP浓度(X,mg·L-1)作线性回归分析,得标准曲线方程:Y＝0.027 7X+0.019 3,r＝0.996 5,结果表明,DFP浓度在0.5～80.0 mg·L-1范围内线性良好,定量下限为0.5 mg·L-1。

2.6 准确度与回收率实验 分别取浓度为1.0, 20.0,80.0mg·L-1的DFP对照品系列水溶液(含定量内标替硝唑84.0 mg·L-1)直接进样,得低、中、高浓度对照品的DFP与内标峰面积比值(Y0)；再按“2.3”项操作取DFP对照品储备液用健康人空白血浆稀释成浓度为1.0,20.0,80.0 mg·L-1(C0)的对照品系列血浆,上清液按“2.1”进样,得DFP和内标峰面积比值(Yt),比值Yt代入标准曲线方程计算DFP的浓度Ct,以Yt/Y0×100%计算即得血浆样本处理的绝对回收率,以Ct/C0×100%计算即得血样处理的方法回收率。结果见表1。

表1 DFP回收率实验结果(n=5)Tab.1 Recovery of Deferiprone(n=5) %,±s

表1 DFP回收率实验结果(n=5)Tab.1 Recovery of Deferiprone(n=5) %,±s

浓度/ (mg·L-1)绝对回收率RSD方法回收率RSD 1.0 93.6±5.24 5.60 107.2±3.22 3.00 20.0 85.6±1.61 1.88 89.9±1.43 1.59 80.0 90.8±1.88 2.07 96.9±2.37 2.45

2.7 精密度实验 按“2.3”项下操作取DFP对照品储备液用健康人空白血浆稀释成浓度为1.0,20.0, 80.0 mg·L-1的对照系列血浆,上清液按“2.1”项色谱条件进样,各浓度于1 d内测定5次和每日测定1次,连续测定5 d。结果见表2。

表2 DFP精密度实验结果 (n=5)Tab.2 Precision of Deferiprone (n=5)

2.8 专属性 分别取含有丙戊酸钠、卡马西平、环孢素A、甲氨蝶呤的患儿血浆,按“2.3”项血样处理操作后按照色谱条件进样；之后平行加入DFP溶液(浓度为399.2 mg·L-1)25μL,按“2.3”项血样处理操作后按照色谱条件进样,考察4种临床儿科常用药物对DFP含量测定的色谱条件影响,结果表明这些药物在该色谱条件下对人体血浆DFP含量测定无干扰。

2.9 β-地中海贫血患儿服用DFP 2 h后测定DFP血药浓度 患儿(男)按25 mg·kg-1一次顿服去铁酮片(加拿大Apotex公司,规格:每片0.5 g),服药后2 h取血浆,按“2.3”项血样处理操作,得色谱图(图2),测得患儿DFP血浆浓度为4.8 mg·L-1。

3 讨论

图2 患者血浆高效液相色谱图1.DFP;2.替硝唑Fig.2 HPLC chromatography of patient plasma1.deferiprone;2.tinidazole

对于流动相的筛选,参考文献［3-8］并结合实验,最终确定以乙腈-50 mmol·L-1磷酸二氢钾(含5 mmol·L-1庚烷磺酸钠、1%三乙胺)＝11∶89为流动相,其中选择的庚烷磺酸钠能与DFP形成离子对形式,消除DFP峰拖尾现象［3］；文献提供的流动相中加入乙二胺四乙酸试剂［3-8］,笔者在本研究也实验过,但均产生峰形拖尾,最后更换为三乙胺；流动相的pH为3［3-8］条件下,峰形拖尾较严重,当在酸性更高条件下,特别调整到pH为1.3时,能较好地解决DFP峰拖尾问题,且血浆杂峰对测定无干扰,内标峰与DFP峰均获得理想的保留时间,所以本实验流动相pH确定为1.3,色谱柱选用耐酸性好的Kromasil C18柱。

根据文献［3-6］报道DFP在紫外波长278 nm处有强的吸收峰,且能减少流动相和血浆对DFP峰的干扰,所以本研究采用该波长作为检测波长；通过筛选咖啡因［9］、甲硝唑［5］等化合物,最终确定峰形良好、保留时间适合的替硝唑作为内标物质。

实验过程选择乙腈作为蛋白沉淀剂,但处理后DFP峰形仍出现拖尾。改用30%硫酸锌做蛋白沉淀剂,DFP峰和内标峰峰形理想,对测定结果无影响。

通过测定1例β-地中海贫血患儿服用DFP后的血药浓度证实该方法的可行性。本方法操作简便易行,快速准确,灵敏度高,专属性强,适合用于临床上测定人体血浆中DFP的含量。

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DOI 10.3870/yydb.2014.02.008

High Performance Liquid Chromatography Method for Determination of Deferiprone in Human Plasma

LU Hua1,CHENG Dao-hai1,LEI Xiao-guang1,HE Yun-yan2,WAN Rui-rong1,SU Ming1,WU Ke-jie3, LUO Jian-ming2
(1.Department of Pharmacy;2.Department of Paediatrics,the First Hospital of Guangχi Medical University,Nanning 530021,China;3.Grade of 2009,Department of Pharmacy,Guilin Medical College,Guilin 541004,China)

Objective To establish a high performance liquid chromatography(HPLC)method for the determination of deferiprone in human plasma.MethodsThe analytical column was a Kromasil C18column(4.6 mm×200 mm,5μm).The mobile phase was amixture of acetonitrile and buffer of50 mmol·L-1potassiumdihydrogen phosphate(containing 5 mmol·L-1sodiumheptanesulfonate and 1%triethylamine)(11∶89,pH adjusted to 1.3 with phosphoric acid).Detection wave-length was set at 278 nm.The column temperature was25℃.The injected volume was20μL.Flow rate was1 mL·min-1.ResultsThe calibration curve of deferiprone were linear in the range of0.5-80.0mg·L-1(r＝0.996 5),and the lower limit of detection was 0.5 mg·L-1.The absolute recoveries of deferiprone at low,mediumand high concentrations weremore than 85.6%,and the method recoveries were more than 89.9%.The intraday coefficients of variation were 1.61%-3.70%,and the interday coefficients of variation were 1.84%-4.81%.ConclusionThemethod is simple,quick,accurate,sensitive,and specific, and can be used in detecting deferiprone concentration in human p lasma.

Deferiprone;Human plasma;High performance liquid chromatography;Content determination

R969.1

A

1004-0781(2014)02-0164-04

2013-03-21

2013-06-30

*广西科技厅自然科学基金面上项目(2012GXNSFAA053145)；广西卫生厅自筹经费科研课题(Z2011347)

陆华(1970-),男,广西南宁人,副主任药师,学士,研究临床合理用药。电话:0771-5356379,E-mail：hualude@sina.com。

罗建明(1958-),男,广西贵港人,主任医师,教授,博士,儿童血液病专业。电话:(0)13517667021,E-mail：luojm06@yahoo.com.cn。