复方替硝唑溶液制备工艺影响因素考察及其稳定性研究

龚 亚，李 敏，曹 健

(陆军军医大学第二附属医院药剂科，重庆 400037)

复方替硝唑溶液在临床上可用于口腔厌氧菌感染及其他细菌感染引起的咽峡炎、牙周炎及口腔溃疡等，其主药为替硝唑和醋酸氯己定[1]。复方替硝唑溶液为某三级甲等医院口腔科治疗厌氧菌常用漱口水之一，据统计，2019年其口腔科门诊适应证患者使用该药的百分比为26%。鉴于替硝唑和醋酸氯己定均在水中微溶，制备工艺中常采用热水溶解主药后冷却，再进行后续制备[1-3]。然而，在制剂配制量较大的情况下，溶液初始温度较高、冷却时间较长可能影响药物的稳定性[4]。本研究对替硝唑和醋酸氯己定溶液的水浴温度和时间进行考察，明确其对复方替硝唑溶液制备工艺的影响；并参考相关文献[5-12],采用经典恒温加热法对复方替硝唑溶液进行稳定性预测，为实际生产条件提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪，包括脱气机、四元泵、自动进样系统、柱温箱、G1314B紫外检测器及Chemstation工作站(美国Agilent公司)；DF-101S集热式加热搅拌器(常州普天仪器制造有限公司)；PHS-3C型精密pH计(上海雷磁仪器厂)；ME235S十万分之一电子天平(德国Sartorius公司)。

1.2 药品与试剂

替硝唑对照品(中国食品药品检定研究院，批号为100336-200703，纯度99.8%)；醋酸氯己定对照品(中国食品药品检定研究院，批号为100183-201003，纯度96.2%)；替硝唑原料药(浙江苏泊尔制药有限公司，批号为001-180446，纯度99.7%)；醋酸氯己定原料药(锦州九泰药业有限责任公司，批号为161105，纯度99.8%)；复方替硝唑溶液(陆军军医大学第二附属医院，批号为190624)。甲醇为色谱纯；磷酸二氢钾、磷酸为分析纯；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为依利特Hypersil BDS-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相以甲醇为A相，甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(pH=3.5)(V∶V=20∶80)为B相，梯度洗脱(0～8 min，0% A→55% A；8～15 min，55% A；15～15.1 min，55% A→0% A；15.1～20 min，0% A)；检测波长280 nm；流速1.0 ml/min；柱温25 ℃；采集时间20 min；进样量10 μl[13]。

2.2 溶液的制备

2.2.1 替硝唑对照品溶液的制备：精密称取替硝唑对照品适量，置于容量瓶中，加水溶解并稀释制成约含替硝唑0.2 mg/ml的溶液，作为替硝唑对照品溶液。

2.2.2 醋酸氯己定对照品溶液的制备：精密称取醋酸氯己定对照品适量，置于容量瓶中，加水溶解并稀释制成约含醋酸氯己定0.2 mg/ml的溶液，作为醋酸氯己定对照品溶液。

2.2.3 混合对照品溶液的制备：分别精密称取替硝唑、醋酸氯己定对照品各适量，置于同一容量瓶中，加水溶解并稀释制成约含替硝唑、醋酸氯己定各0.2 mg/ml的溶液，作为混合对照品溶液。

2.2.4 供试品溶液的制备：上述同法采用替硝唑和醋酸氯己定原料药制备替硝唑溶液、醋酸氯己定溶液及其混合溶液，各溶液中替硝唑和醋酸氯己定含量均约为0.2 mg/ml。

2.3 系统适用性试验

取混合对照品溶液、复方替硝唑溶液和复方替硝唑溶液加速试验样品(90 ℃水浴1 h)适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，见图1。由图1可知，主成分替硝唑、醋酸氯己定的出峰时间分别为6.1、14.6 min，二者分离度>1.5，理论板数均>2 000，出峰顺序与文献[13]报道一致。

A.混合对照品；B.复方替硝唑溶液；C.复方替硝唑溶液加速 试验样品(90 ℃水浴1 h)； 1.替硝唑；2.醋酸氯己定A. mixed reference substance; B. compound tinidazole solution; C.accelerated test sample of compound tinidazole solution (water bath at 90 ℃ for 1 h)； 1. tinidazole; 2. chlorohexidine acetate图1 系统适用性高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms of instrument suitability

2.4 温度和时间的考察

将替硝唑溶液、醋酸氯己定溶液、混合溶液分别置于50、60、70、80及90 ℃恒温水浴锅中，于0、1、2、4、6和8 h取样，按“2.1”项下色谱条件，测定替硝唑降解产物(保留时间为4.6 min)、替硝唑(保留时间为6.1 min)和醋酸氯己定(保留时间为14.6 min)的相对百分含量。替硝唑及其降解产物含量见图2—3，醋酸氯己定在本研究条件下降解量<3%。由图2—3可知，降解产物在替硝唑溶液中的出现时间为70 ℃下6 h、80和90 ℃下1 h，在混合溶液中分别为60 ℃下8 h、70 ℃下2 h、80和90 ℃下1 h。结果表明，随温度升高、时间延长，替硝唑含量降低，降解产物随之增多，且醋酸氯己定的存在对替硝唑的降解具有协同作用，故复方替硝唑溶液配制过程中建议替硝唑在60 ℃以下单独溶解；醋酸氯己定在本研究条件下相对稳定。

2.5 复方替硝唑溶液稳定性预测

按经典恒温加热法，将复方替硝唑溶液分装于干燥洁净的100 ml容量瓶中，分别置于50、60、70、80、85、90及95 ℃恒温水浴锅中，于0、6、12、24、36和48 h取样，按“2.1”项下色谱条件，测定替硝唑和醋酸氯己定的浓度。测定结果显示，醋酸氯己定稳定性远远高于替硝唑，替硝唑降解情况见图4。

表1 复方替硝唑溶液中替硝唑降解速率常数Tab 1 Degradation rate constant of tinidazole in compound tinidazole solution

3 讨论

某院自制制剂留样观察结果证明，复方替硝唑溶液在

A.50 ℃；B.60 ℃；C.70 ℃；D.80 ℃；E.90 ℃A.50 ℃; B. 60 ℃; C. 70 ℃; D. 80 ℃; E. 90 ℃图2 温度和时间对替硝唑含量的影响Fig 2 Effects of temperature and time on the contents of tinidazole

A.50 ℃；B.60 ℃；C.70 ℃；D.80 ℃；E.90 ℃A. 50 ℃; B. 60 ℃; C. 70 ℃; D. 80 ℃; E. 90 ℃图3 温度和时间对替硝唑降解产物含量的影响Fig 3 Effects of temperature and time on the contents of degradation product of tinidazole

图4 温度和时间对复方替硝唑溶液中替硝唑含量的影响Fig 4 Effects of temperature and time on the contents of tinidazole in compound tinidazole solution

1年有效期内稳定性良好。复方替硝唑溶液留样观察、稳定性预测及替硝唑溶液温度考察图谱中，均出现同一降解产物峰，结合文献，推测该降解产物为2-甲基-5-硝基咪唑(替硝唑杂质Ⅰ)[15-18]，为该制剂有关物质的考察提供了参考。

醋酸氯己定相对稳定[19-20]。在复方替硝唑溶液生产和储存过程中主要考虑替硝唑的稳定情况。醋酸氯己定对替硝唑的降解具有协同作用，经测定，本研究中替硝唑溶液、醋酸氯己定溶液及混合溶液的pH分别为5.8、6.5及6.7。涂家生等[15]的研究结果发现，替硝唑溶液在pH为4.0～5.5范围内最稳定，当pH>6.5，则降解明显加快。因此，推测该协同作用是醋酸氯己定引起溶液pH改变所致。

《中华人民共和国药典》[2]凡例中规定，热水温度指70～80 ℃。经验证，替硝唑和醋酸氯己定的溶解度分别为4.7和12.8 mg/ml(25 ℃)。实际生产过程中，替硝唑和醋酸氯己定在初步溶解阶段，其浓度远远高于本研究所用的溶液浓度，且生产量大、冷却时间长，因此，工艺中采用热水助溶对替硝唑含量的影响更大。鉴于醋酸氯己定对替硝唑的降解具有协同作用，在复方替硝唑溶液配制过程中，结合实际工作，建议替硝唑在60 ℃以下单独溶解，减少降解产物的生成。