灵芝多糖对糖尿病大鼠肾脏保护作用机制研究*

袁荣高，杨留才，刘德军，李仕红，徐红涛

(1．连云港中医药高等职业技术学校，连云港 222006；2．盐城卫生职业技术学院，盐城 224006)

灵芝多糖对糖尿病大鼠肾脏保护作用机制研究*

袁荣高1，杨留才2，刘德军1，李仕红2，徐红涛2

(1．连云港中医药高等职业技术学校，连云港 222006；2．盐城卫生职业技术学院，盐城 224006)

目的研究灵芝多糖对糖尿病(DM)模型大鼠肾脏保护作用及分子机制。方法建立DM大鼠模型,分为对照组、模型组和药物治疗组,药物治疗组用灵芝多糖治疗8周。观察3组大鼠肾功能指标、氧化-抗氧化指标、原位末端标记(TUNEL)法检测肾脏细胞凋亡,Western-blot检测Bcl-2、转化生长因子-β1(TGF-β1)和Bax在肾脏的蛋白表达水平。结果药物治疗组的肾功能指标好于模型组,低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);药物治疗组肾皮质的丙二醛(MDA)低于模型组,高于对照组;超氧化物歧化酶(SOD)高于模型组,低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);药物治疗组肾脏细胞凋亡率低于模型组,高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);药物治疗组肾皮质的Bcl-2蛋白表达水平高于模型组,低于对照组,BAX和TGF-β1蛋白表达水平低于模型组,高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论灵芝多糖可能通过改善DM大鼠氧化应激水平和抑制肾脏细胞凋亡保护DM大鼠的肾功能。

灵芝多糖；糖尿病；氧化应激；凋亡

糖尿病(diabetesmellitus,DM)是中老年人高发的一种慢性非感染性疾病［1］,其临床表现为以高血糖为主的临床综合征［2-3］。DM随着病程的进展,会对体内如肾脏、视网膜等多个器官造成损害,导致产生DM眼病、2型糖尿病肾病等多种严重的并发症,其中糖尿病肾病是上述并发症中最严重的一种,往往会因为肾脏功能的衰竭而导致患者死亡［4］。研究表明,糖尿病患者的体内氧化-抗氧化平衡被破坏,氧化应激水平增高,从而对肾脏等多个器官造成损伤［5］。通过对DM动物模型使用抗氧化剂a-硫辛酸能够有效降低氧化应激水平,减少肾脏损伤［6］。研究表明,灵芝中的主要药理成分为灵芝多糖(ganoderma lucidumpolysaccharides,GLPs),通过对GLPs的药理作用研究发现,GLPs具有清除体内自由基的作用,从而发挥抗氧化和延缓衰老等功能。同时,研究还发现,GLPs能够改善DM大鼠胰岛细胞的凋亡［7］。笔者研究GLPs对DM大鼠肾脏是否有保护作用,并且探讨其机制,从而为选择治疗糖尿病肾病的药物提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物 健康雄性Wistar大鼠,8周龄,体质量200～220 g,南通大学实验动物中心提供,动物使用许可证号:SYXK(苏)2002-0022。

1.2 试药与材料 灵芝多糖(江苏安惠生物科技有限公司,批号:120601)；链脲佐菌素,高脂饮食(饲料配方为脂肪25%、蛋黄粉5%、基础饲料70%,南通特洛菲饲料科技有限公司生产)。血液尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(creatinine,Cr)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)试剂盒,购于南京建成生物工程研究所。TUNEL试剂盒(瑞士罗氏公司生产)；鼠源单克隆多克隆Bcl-2抗体(1∶500)、鼠源单克隆Bax抗体(1∶500),鼠源单克隆转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)抗体(1∶500)均购于美国Merck公司,辣根过氧化物酶标志羊抗鼠二抗(1∶4 000,美国Sigma公司)。

1.3 2型糖尿病大鼠动物模型的制作 选择8周龄健康雄性Wistar大鼠40只,按照文献［8］制作2型糖尿病模型。按随机数字表法将大鼠分为2组,其中1组10只大鼠,作为正常组；另一组大鼠30只,从左下腹腔单次注射链脲佐菌素溶液65 mg·kg-1,禁食48 h后经尾尖取血测空腹血糖,以血糖≥11.1 mmol·L-1作为DM模型制作成功。30只大鼠中28只建模成功,将28只建模成功大鼠随机均分为模型组和药物治疗组,每组大鼠14只。其中药物治疗组每日使用灵芝多糖400 mg·kg-1经食管灌注,持续10周。3组大鼠均予以高脂饮食。

1.4 实验方法 实验进行到10周时,所有实验组大鼠均在空腹下腹腔注射水合氯醛进行麻醉,分离双肾,左肾用多聚甲醛进行固定,右肾取肾皮质于-80℃保存用于氧化-抗氧化指标检测和Western-blot实验。

1.5 测定指标

1.5.1 血肾功能指标 在实验进行到第10周时,代谢笼收集24 h尿液,使用免疫比浊法测定3组24 h尿蛋白(24 h urinary albumin,24 hUAlb)含量。大鼠心脏采血后处死,使用全自动生化分析仪测定3组血液中尿BUN、Cr浓度。

1.5.2 氧化-抗氧化指标检测 取部分冷冻保存的肾皮质,制备成10%组织匀浆,使用硫代巴比妥酸法测定血浆MDA,用二硫代二硝基苯甲酸比色法测定红细胞SOD活性。

1.5.3 TUNEL检测 使用多聚甲醛固定的肾脏经过常规脱水、石蜡包埋,以5 mm连续切片,常规脱蜡水化,按照TUNEL试剂盒的要求进行操作。在光镜下观察以细胞核被染成棕色作为阳性细胞,统计在高倍镜视野下的阳性率。

1.5.4 Bcl-2、Bax和TGF-β1的western-blot检测 大鼠肾脏提取蛋白后110 V恒压电泳2 h,恒流0.3 A转移60 min。以鼠源单克隆多克隆Bcl-2抗体(1∶500)、鼠源单克隆Bax抗体(1∶00)和鼠源单克隆TGF-β1抗体(1∶500)分别在4℃下孵育过夜,使用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)进行反复冲洗5 min,使用辣根过氧化物酶标志羊抗鼠二抗(1∶4 000)室温孵育1 h,将ChemiluminescentSubstrate kit A液和B液各300 mL混合反应1 min,进行曝光、显影、定影。扫描分析实验结果。使用btubulin作为内参对照。利用图像分析软件计算相对内参对照的相对积分光密度值。

1.6 统计学方法 所有数据均输入SPSS 18.0版统计学软件进行统计分析,计量资料采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肾功能比较 治疗完成10周后对照组、模型组和药物治疗组的肾功能比较见表1。

表1 3组大鼠肾功能比较Tab.1 Comparison of renal function among three groups of rats ±s

表1 3组大鼠肾功能比较Tab.1 Comparison of renal function among three groups of rats ±s

与对照组比较,*1P<0.05;与模型组比较,*2P<0.05Comparewith control group,*1P<0.05;Compare withmodel group,*2P<0.05

组别大鼠/只BUN Cr (mmol·L-1) 24 hUAlb/ mg药物治疗组14 9.82±2.87*1*238.95±9.65*1*265.21±17.59*1*2模型组14 14.63±1.49*170.31±16.32*1106.54±21.57*1对照组10 5.67±0.96 13.14±3.69 9.57±2.17

2.2 大鼠肾皮质氧化-抗氧化指标比较 10周后对照组、模型组和药物治疗组的肾皮质氧化-抗氧化指标见表2。

表2 3组大鼠肾皮质氧化-抗氧化指标比较Tab.2 Comparison of the oxidation and anti-oxidation index in renal cor tex among three groups of rats ±s

表2 3组大鼠肾皮质氧化-抗氧化指标比较Tab.2 Comparison of the oxidation and anti-oxidation index in renal cor tex among three groups of rats ±s

与对照组比较,*1P<0.05;与模型组比较,*2P<0.05Compare with control group,*1P<0.05;Compare with model group,*2P<0.05

组别大鼠/只MDA/ (nmol·mg-1·prot) SOD/ (nU·mg-1)药物治疗组14 2.76±0.57*1*2119.58±12.79*1*2模型组14 3.81±0.79*196.62±15.32*1对照组10 2.15±0.42 134.75±16.23

2.3 大鼠肾脏凋亡情况比较 通过对3组大鼠的肾脏皮质进行TUNEL染色,结果发现对照组的TUNEL染色细胞阳性率为(10.26±3.15)%,药物治疗组为(23.56±6.87)%,模型组为(34.87±12.35)%,对照组细胞阳性率低于药物治疗组和模型组,差异有统计学意义(P<0.05),药物治疗组的凋亡细胞阳性率低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.4 大鼠肾皮质Bcl-2和Bax蛋白水平表达比较 对照组、药物治疗组和模型组的Bcl-2和Bax蛋白水平比较见表3,图2。

3 讨论

本研究通过建立DM大鼠模型观察2型糖尿病肾脏的损害,并且观察灵芝多糖是否能够保护DM对肾脏的损害,并探讨其机制。本研究结果表明,DM大鼠的血BUN、Cr和UEAR均高于正常大鼠,而经过灵芝多糖处理的DM大鼠血BUN、Cr和UEAR均高于正常大鼠,并且DM肾脏TGF-β1蛋白表达水平高于正常大鼠,并且差异有统计学意义(P<0.05)。DM对肾功能能够造成一定的损伤,并且灵芝多糖能够在一定程度上保护DM大鼠的肾功能。研究表明,DM能够导致氧化-抗氧化平衡发生紊乱,导致体内氧化应激水平明显提高,脂质发生过氧化,导致肾脏、视网膜等器官发生病变［9］。2型糖尿病大鼠肾皮质的MDA明显增高,而SOD明显降低,在经过灵芝多糖处理后,MDA较未经处理的DM大鼠降低,而SOD则明显增高,并且差异均有统计学意义。MDA是自由基作用于脂质发生过氧化反应的氧化终产物,引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合,具有很强的细胞毒性［10］,MDA的量常常反映机体内脂质过氧化的程度,间接反映出细胞损伤的程度［11］。而SOD则是生物体内重要的抗氧化酶［12］,广泛分布于各种生物体内［13］,其主要的生理活性是清除生物体内自由基［14］。本研究结果不仅和上述的研究结果基本一致,还证明灵芝多糖能够有效地恢复原本已经紊乱的DM大鼠的氧化-抗氧化平衡。

图1 3组大鼠肾皮质细胞凋亡水平比较(×400)A.对照组;B.药物治疗组;C.模型组Fig.1 Comparison of cell apoptosis in renal cortex among three groups of rats(×400)A.control group;B.drug treatment group;C.model group

表3 3组大鼠肾皮质Bcl-2、Bax和TGF-β1蛋白水平表达相对积分吸光度值比较Tab.3 Comparison of relative integral optical density value of Bcl-2,Bax and TGF-β1protein expression in renal cortex among three groups of rats %,±s

表3 3组大鼠肾皮质Bcl-2、Bax和TGF-β1蛋白水平表达相对积分吸光度值比较Tab.3 Comparison of relative integral optical density value of Bcl-2,Bax and TGF-β1protein expression in renal cortex among three groups of rats %,±s

与对照组比较,*1P<0.05;与模型组比较,*2P<0.05Compare with control group,*1P<0.05;Compare with model group,*2P<0.05

组别大鼠/只Bcl-2 Bax TGF-β1药物治疗组14 154.23±33.57*1*2245.18±40.21*1*279.65±20.57*1*2模型组14 102.35±19.87*1331.45±54.21*1213.68±31.59*1对照组10 234.87±45.62 125.64±22.31 32.56±6.26

图2 各组大鼠肾皮质Bcl-2、Bax和TGF-β1蛋白水平表达比较A.对照组;B.药物治疗组;C.模型组Fig 2 Comparison of Bcl-2,Bax and TGF-β1protein expression levels in renal cortex among three groups of ratsA.control group;B.drug treatment group;C.model group

此外,TUNEL染色研究结果还发现,DM大鼠肾皮质的细胞凋亡率明显增高,经过CLPs处理后,其细胞凋亡率有所降低。DM大鼠肾皮质细胞发生凋亡的主要原因在于MDA等氧化产物对肾小球细胞的损害,导致肾小球细胞发生凋亡。为了进一步探明其机制,通过western-blot的手段检测肾皮质内的Bcl-2和Bax的蛋白表达水平。结果发现,DM大鼠的Bcl-2较正常大鼠明显下调,而Bax则明显上调。经过CLPs处理后,DM大鼠Bcl-2较未经处理的DM大鼠有所上调,而 Bax则有所下调。Bcl-2基因(即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因)是一种原癌基因,它具有抑制凋亡的作用,最初在血液淋巴细胞中发现Bcl-2能抑制细胞死亡［15-16］,随后陆续在其他一些细胞中也发现Bcl-2也具有抑制凋亡的作用［17］。实验结果表明,Bcl-2的过度表达可减少氧自由基的产生和脂质过氧化物的形成［18］,此外,Bcl-2还可以抑制Cyt c的释放,从而抑制超氧阴离子的产生［15］。此外,Bcl-2还可以通过抑制钙离子跨膜流动等方式抑制细胞凋亡［19］。Bax是Bcl家族成员之一,但是其主要的生理功能和Bcl-2相反, Bax能够和Bcl-2结合形成同源二聚体来促进细胞的凋亡［20］。本研究结果也显示,CLPs能够通过上调Bcl-2和下调Bax的蛋白表达水平减少肾小球细胞的凋亡。本研究结果表明,CLPs一方面通过提高SOD活性,降低过高的MDA水平,维持机体的氧化与抗氧化平衡；另一方面通过促进Bcl-2蛋白表达同时抑制Bax蛋白表达来调节Bcl-2和Bax的比例,保护DM大鼠的肾功能。

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DOI 10.3870/yydb.2014.02.003

Kidney Protective Effect of Ganoderma LucidumPolysaccharide in Diabetic Rats

YUAN Rong-gao1,YANG Liu-cai2,LIU De-jun1,LI Shi-hong2,XU Hong-tao2
(1.Lianyungang High Vocational and Technical School of Chinese Medicine,Lianyungang 222006,China;2.Yancheng Health Vocational and Technical College,Yancheng 224006,China)

Objective To study the effects of the polysaccharides of Ganoderma lucidumon the kidneys of diabetes mellitus(DM)rats and the related molecularmechanism.MethodsThe DMratmodel was established.The DMrats were divided into control group,model group and treatment group.The treatment group was treated by Ganoderma lucidumpolysaccharides for 8 weeks.The rat renal function profile,oxidation and anti-oxidation index were determined.TUNEL assay method was used for the detection of renal cell apoptosis.The expression levels of Bcl-2,TGF-β1and Bax in the kidney were determined byWestern blotting.ResultsAfter treatmentwith Ganoderma lucidumpolysaccharide,renal function profile in the treatment group was significantly better than that in themodel group,and worse than that in the control group(bothP<0.05). Renal cortical MDA of treatment group was significantly lower than that ofmodel group,and higher than that of the control group (bothP<0.05).SOD of the treatment group was significantly higher than that of the model group,and lower than that of the control group(bothP<0.05).Renal cell apoptosis rate of the treatment group was significantly lower than that of themodel group,and higher than that of the control group(bothP<0.05).Renal cortical Bcl-2 expression level of the treatment group was significantly higher than that ofmodel group,and lower than that of the control group(bothP<0.05).The expression levels ofBAX and TGF-β1protein of the treatment group were significantly lower than those in themodel group,and higher than those of the control group(bothP<0.05).ConclusionGanoderma lucidumpolysaccharidesmay improve oxidative stress and inhibit renal apoptosis of renal cells to protect the renal function of DMrats.

Ganoderma lucidumpolysaccharide;Diabetesmellitus;Oxidative stress;Apoptosis

R965

A

1004-0781(2014)02-0144-05

2013-03-12

2013-05-08

*盐城市医学科技发展计划项目(YK2010112)

袁荣高(1969-),男,江苏盐城人,副教授,学士,研究方向:衰老的相关性基因研究。电话:(0) 15961398118,E-mail：15961398118@163.com。

杨留才(1967-),男,江苏盐城人,教授,学士,研究方向:疾病相关基因研究。电话:(0)13851083108,E-mail：jsyc.ylc@163.com。