绞股蓝皂苷对2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病模型大鼠肝纤维化影响*

赵世印，邱华，贺琴，李德梅，谭华炳

(1．湖北医药学院附属人民医院感染性疾病科、肝病研究室，十堰 442000；2．湖北省房县红塔镇卫生院内科，房县 442100)

绞股蓝皂苷对2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病模型大鼠肝纤维化影响*

赵世印1，2，邱华1，2，贺琴1，李德梅1，谭华炳1

(1．湖北医药学院附属人民医院感染性疾病科、肝病研究室，十堰 442000；2．湖北省房县红塔镇卫生院内科，房县 442100)

目的观察绞股蓝皂苷(GPS)对2型糖尿病(T2DM)合并非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠肝纤维化的影响。方法通过高脂饲养联合链脲佐菌素注射建立T2DM并发NAFLD模型(M组)、NAFLD模型(NM组),T2DM并发NAFLD模型给予GPS(1 g·kg-1·d-1)(JH组),GPS(0.5 g·kg-1·d-1)干预(JL组)。定量聚合酶链反应(PCR)技术检测肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA);检测血糖(BG)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、透明质酸(HA)的变化;免疫组化染色检测肝组织层粘连蛋白(LN)表达。结果肝组织α-SMA表达:以空白对照组(N组)扩增倍数为1计算,M组为3.17,与N组比较差异有统计学意义(P<0.01);NM组为2.37,与N组比较差异有统计学意义(P<0.01);JH组为2.26,与M组比较差异有统计学意义(P<0.01);JL组为2.63,与JH组比较差异有统计学意义(P<0.05)。肝组织LN免疫组织化学检测:M组LN沉积最严重,JL与NM组程度相似;JH组LN沉积最轻。HA变化:M组、NM组、JH组、JL组明显上升,与N组比较差异有统计学意义(P<0.01),JH组、JL组与M组比较差异有统计学意义(P<0.01)。血糖水平:JH组(10.86±3.46)mmol·L-1、JL组(14.78±3.39)mmol·L-1,与M组(18.84±4.24)mmol·L-1比较差异有统计学意义(P<0.01)。血TG水平:JH组(1.83±0.56)mmol·L-1、JL组(2.82±0.66)mmol·L-1,与M组(3.97±0.64)mmol·L-1比较差异有统计学意义(P<0.01)。血TC水平:JH组(1.41±0.10)mmol·L-1,JL组(1.49±0.20)mmol·L-1,与M组(1.85±0.12)mmol·L-1比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论GPS能降低T2DM合并NAFLD大鼠肝纤维化程度。

绞股蓝皂苷；糖尿病,2型；肝病,脂肪性,非酒精性；肝纤维化

2型糖尿病(type 2 diabetesmellitus,T2DM)患者非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)检出率为50.45%［1］；合并NAFLD的T2DM人群发生心血管疾病的风险增加［2］；NAFLD被认为与至少20%原因不明的肝硬化病例密切相关［3］；T2DM是肝硬化发生的一个重要危险因素［4］。研究T2DM合并NAFLD肝纤维化对预防肝硬化具有重要意义。肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)在肝纤维化形成过程中具有核心作用。激活的HSC发生表型转变成为肌成纤维细胞,特异性表达α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA),大量合成细胞内基质(extracematrix,ECM),产生纤维化［5］。透明质酸(hyaluronic acid,HA)、层粘连蛋白(laminin,LN)是肝纤维化的两个重要指标,笔者在本研究中通过定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测肝组织α-SMA、免疫组化检测肝组织LN、检测血液HA,观察绞股蓝皂苷(gypenosides,GPS)对T2DM并发NAFLD大鼠肝纤维化的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠65只,体质量220～250 g,由湖北医药学院动物实验中心提供,合格证号:SCXK(湘)2009-0004。实验场地湖北省十堰市实验动物中心(湖北省实验动物设施使用证明号: 00015644)。

1.2 实验饲料 普通饲料由湖北医药学院动物实验中心提供。胆固醇购自北京双旋生物培养基制品厂。猪油由市售板油自行炼制而成,蛋黄粉由市售鸡蛋自行制作。高糖高脂饲料由湖北医药学院动物实验中心按实验配方配制使用(配方:78%普通饲料+2.5%胆固醇+8%蛋黄+7%猪油+4.5%蔗糖)。高脂饲料由湖北医药学院动物实验中心按照实验设计配方配制使用(配方:82.5%普通饲料+2.5%胆固醇+8%蛋黄+7%猪油)。

1.3 材料与设备 全自动生化检测仪(瑞士产, Roche/Hitache7600),三酰甘油(triglycerides,TG)、胆固醇(cholesterol,TC)、血糖(blood glucose,BG)检测试剂为公司原装进口试剂。SN-697型全自动双探头放射免疫γ计数器(上海原子核研究所四环仪器一厂)；HA、LN试剂购自北京北方生物技术研究所。冷冻低温离心机(上海中科生物医学高科技开发有限公司, DL-45R-L)。链脲佐菌素(streptozocin,STZ)购自Sigma公司。GPS 购自安康东科麦迪森天然药业有限公司,纯度为98%。肝组织LN免疫组织化学染色检查使用武汉谷歌生物科技有限公司全套设备,LN抗体购自武汉博士德生物工程有限公司(bs0821R)。α-SMA检测设备和试剂为武汉谷歌生物科技有限公司全套设备、试剂。

1.4 实验模型的建立

1.4.1 实验动物的分组 大鼠购入后,饲养观察1周。按照实验设计将65只大鼠分为空白对照组(7只,N组),NAFLD模型组(NM组,7只),T2DM并NAFLD模型组(51只)。

1.4.2 实验动物的管理 参照文献［6］,每只鼠每天高糖高脂饲料约20 g,分两次投入,喂养4周；大鼠隔夜空腹腹腔注射STZ 40 mg·kg-1,48 h后尾静脉取血,BG>11.1 mmol·L-1,纳入实验组,造模成功率为100%；继续给予高糖高脂饲料喂养至8周,期间大鼠死亡15只。将全部大鼠分为GPS大剂量组(9只,JH组),灌胃给予GPS 1 g·kg-1·d-1；GPS小剂量组(9只,JL组),灌胃给予GPS 0.5 g·kg-1·d-1；T2DM并发NAFLD模型对照组(9只,M组)灌胃给予同体积的纯净水；继续给予高糖高脂饲料,自由饮水；治疗周期为6周；实验周期14周。N组每天给予普通饲料约20 g(根据NAFLD组进食量调整)；NM组给予高脂饲料约20 g(依据前1 d进食量决定第2天进食量)；饲料分2次投入。自由饮水。实验周期14周。

1.5 标本的采集与检测

1.5.1 血液标本的采集与处理 实验结束时,10%水合氯醛腹腔注射麻醉,暴露腹主动脉,经腹主动脉采集血液10 mL分别置于肝素管和促凝管,离心取血浆和血清,保存于-20℃的冰柜中待检。同步按仪器和试剂说明书要求,检测血浆TG、TC、BG和血清HA、LN。

1.5.2 α-SMA检测设备、试剂、方法 总RNA抽提按Trizol说明书进行。反转录(取PCR管,加入含RNA 2μg的溶液；加入1μL oligo(dT)15；用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μL；于PCR仪上70℃保温5 min,迅速置冰上冷却；依次加入4μL 5×buffer,2μL 10 mmol·L-1dNTPs,RNA inhibitor和反转录酶各1μL,用移液器抽吸混匀；于PCR仪上42℃保温30 min,结束后80℃保温5 min灭活反转录酶)。定量PCR(取0.2 mL PCR管,配制如下反应体系,每个反转录产物配制3管,2×qPCR Mix 12.5μL, 2.5μmol·L-1基因引物2.0μL,反转录产物2.0μL, ddH2O 8.5μL；取0.2 mL PCR管,配制如下反应体系,每个反转录产物配制3管,2×qPCR Mix 12.5μL, 2.5μmol·L-1内标引物2.0μL,反转录产物2.0μL,ddH2O 8.5μL)。PCR扩增(预变性95℃1 min,循环(40次)95℃,15 s→58℃,20 s→72℃,20 s,末段延72℃5 min,溶解曲线72℃→95℃,每20 s升温1℃)。结果处理采用ΔΔCT法。

1.5.3 肝组织免疫组织化学染色检测LN 按石蜡切片免疫组织化学检测操作常规进行。

1.6 统计学方法 所有数据采用SPSS 9.0版统计学软件处理,数据以均数±标准差(±s)表示,治疗前后组内及组间比较用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验过程中大鼠数量 模型组在T2DM并NAFLD造模过程中,死亡大鼠15只,死亡率为29.41%；在干预过程中,JH组、JL组、M组分别有1, 2,3只大鼠死亡,实验结束JH组大鼠8只,JL组7只, M组6只,NM组6只。N组大鼠饲养过程中无死亡。

2.2 HA变化 M组、NM组、JH组、JL组与N组比较差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05),JH组、JL组低于M组,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。见表1。

2.3 TG、TC、BG检测值 M组、NM组、JH组、JL组与N组比较差异有统计学意义(P<0.01)；JH组、JL组与M组比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

2.4 α-SMA表达变化 以N组扩增倍数为1计算,M组为3.17,与N组比较差异有统计学意义(P<0.01)；NM组为2.37,与N组比较差异有统计学意义(P< 0.01)；JH组表达降至2.26,与M组比较差异有统计学意义(P<0.01)；JL组表达降至2.63,与JH组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5 肝组织免疫组织化学染色检测 M组LN沉积最严重,JL与NM组程度相似；JH组LN沉积最轻。见图1。

3 讨论

肝纤维化是慢性肝病向终末型肝病发展的必由之路。抑制肝纤维化就是抑制终末型肝病的发生。近年来,由T2DM、NAFLD等代谢性疾病导致的肝纤维化已经成为肝纤维化的主要原因。研究T2DM合并NAFLD具有重要意义。

表1 5组大鼠BG、TG、TC、HA的测定值Tab.1 Determination results of BG,TG,TC and HA in five groups of rats ±s

表1 5组大鼠BG、TG、TC、HA的测定值Tab.1 Determination results of BG,TG,TC and HA in five groups of rats ±s

与N组比较,*1P<0.01,*4P<0.05;与M组比较,*2P<0.01,*3P<0.05Compared with N group,*1P<0.01,*4P<0.05;Compared with Mgroup,*2P<0.01,*3P<0.05

组别大鼠/只BG TG TC (mmol·L-1) HA/ (ng·mL-1) M组6 18.84±4.24*13.97±0.64*11.85±0.12*1280.86±24.24*1NM组6 9.84±3.25*1*22.76±0.72*1*31.47±0.13*3*4204.34±19.56*1*2JH组8 10.86±3.46*1*21.83±0.56*1*21.41±0.10*3*4199.92±18.28*1*2JL组7 14.78±3.39*1*32.82±0.66*1*31.49±0.20*3*4238.26±20.86*1*2N组7 5.65±0.52 0.96±0.09 1.10±0.10 64.12±6.98

图1 肝组织LN免疫组织化学染色(×400)N.正常对照组;M.模型组;NM.非酒精性脂肪性肝病组;JH.大剂量GPS干预组;JL.小剂量GPS干预组Fig.1 Immunohistochemical staining on Laminin in hepatic tissue(×400)N.normal control group;M.model group;NM.Nonalcoholic fatty liver;JH.model group treated with high-dose GPS;JL.model group treated with low-dose GPS

本研究肝脏病理学、BG、TG、TC检测显示M组、JH组、JL组T2DM并NAFLD模型及NM组NAFLD模型已经建立,血糖、血脂检测显示GPS大、小剂量均有降低血糖、调整血脂代谢作用,并呈剂量依赖性［7］；GPS具有剂量依赖性干预T2DM并发NAFLD脂肪肝程度的作用。

HSC的激活和增殖,HSC活化是肝纤维化的中心环节［8］。α-SMA是HSC活化程度和肝纤维化进展的一个重要指标已经为学界所认同。本研究显示,T2DM并发NAFLD、NAFLD大鼠均有明显α-SMA表达,JH组、JL组均有降低α-SMA表达的作用,说明GPS具有抑制HSC激活和增殖,从而抑制纤维化作用。

HA浓度升高被认为与HSC合成和分泌增多,及肝窦内皮细胞(LSEC)摄取和降解功能减退有关,HA是反映LSEC表型发生改变的标志。LN可作为肝窦毛细血管化基底膜形成的一个重要标志［9］。LSEC是特殊化的毛细血管内皮细胞,在肝窦形成无隔膜、无BM的窗孔(fenestrae),窗孔结构有利于肝细胞和血液之间进行物质交换,在维持肝脏结构和实现各种功能中起着非常重要的作用,HA、LN的升高提示ECM生成增多、吸收减少,肝纤维化加重。肝脏LN免疫组化显示JH组、JL组LN表达较M组显著下降,JH组轻于JL组；血液生化检验提示与M组比较,JH组、JL组HA、LN下降,具有剂量依赖性。进一步说明GPS具有抑制肝纤维化作用。

中医认为T2DM并发NAFLD是由于湿热内蕴、痰瘀互结,需要清热解毒。绞股蓝是传统的清热解毒药物。现代药理研究证明,绞股蓝含有83种与人参皂苷有类似骨架达玛烷型GPS,皂苷具有抗炎、降低血脂、降血糖和免疫调节等多方面的生物活性和药理作用［10］,NORBERG等［11］从绞股蓝中分离提纯出一种新的皂苷,存在4种可以相互转化的立体异构体,在体外及动物实验中均发现,其可刺激胰岛细胞释放胰岛素,且呈现剂量依赖性。XU等［12］对绞股蓝中分离得到的皂苷及其衍生物的降糖作用进行了研究,发现其可以通过抑制蛋白酪氨酸磷脂酶来控制胰岛素的敏感度。说明GPS具有降低血糖作用。高血糖可促进大鼠肝纤维化形成及HSC的活化［13］,GPS通过多种机制对血糖升高具有抑制作用,这可能是GPS抑制T2DM并发NAFLD大鼠肝纤维化的另一机制。

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DOI 10.3870/yydb.2014.02.006

Effect of Gepenoside on Hepatic Fibrosis of Rats with Type 2 Diabetes Mellitus and Nonalcoholic Fatty Liver Disease

ZHAO Shi-yin1,2,QIU Hua1,2,HE Qin1,LI De-mei1,TAN Hua-bing1
(1.Department of Infectious Disease and Liver Disease,Renmin Hospital of Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China;2.Department of Internal Medicine,Fangχian Hongta Township Health Hospital,Fangχian 442100,China)

Objective To investigate the effect of gepenoside(GPS)on hepatic fibrosis of rats with type 2 diabetes mellitus(T2DM)and non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD).MethodsT2DMand NAFLD model(group M)and NAFLD model(group NM)were established by feeding the ratswith high-fat diet and injection of streptozotocin.The T2DMand NAFLDmodelwas administered with GPS(1 g·kg-1·d-1)(group JH)or GPS(0.5 g·kg-1·d-1)(group JL).α-SMA in the liver tissueswas determinied by quantified PCR.Blood glucose,triacylglycerol(TG),total cholesterol(TC)and hyaluronic acid were examined.Laminin(LN)expression in liver tissues was detected by immunohistocheministry.Resultsα-SMA expression in the liver tissueswas as follows:the amplification ofα-SMA in group N was regarded as1,and that in group Mwas 3.17,with significant difference(P<0.01);The amplification ofα-SMA in group NMwas 2.37(P<0.01 vs.group N);That was 2.26 in group JH(P<0.01 vs.group M);Thatwas2.63 in group JL(P<0.05 vs.group JH).LN expression levelswere as follows:greatest in group M,middle in group JL and MN,lowest in group JH.HA was significantly increased in groups M,NM, JH,and JL(P<0.01 vs.group N).There were significant differences in HA between group JH,JL and group M(P<0.01). There were significant differences in blood glucose levels,TG and TC between group JH［(10.86±3.46),(1.41±0.10)and (1.83±0.56)mmol·L-1］,group JL［(14.78±3.39),(1.49±0.20)and(2.82±0.66)mmol·L-1］and group M［(18.84±4.24),(1.85±0.12)and(3.97±0.64)mmol·L-1］(P<0.01).Significant differences in blood glucose and TG were also found between group JH and group JL(P<0.05,P<0.01).ConclusionGPS can alleviate hepatic fibrosis of rats with T2DMand NAFLD.

Gypenoside;Diabetesmellitus,type 2;Liver disease,fatty,non-alcoholic;Hepatic fibrosis

R965

A

1004-0781(2014)02-0156-04

2013-04-05

2013-05-22

*2009年湖北省卫生厅科研项目(JX4B59)。

赵世印(1963-),男,湖北房县人,副主任医师,主要研究方向:从事中西医结合内科临床工作。电话:0719-3224515。

谭华炳(1963-),湖北房县人,男,主任医师,教授,学士,主要研究方向:从事肝病临床教学科研工作。电话: (0)13707287512,E-mail：renmthb@163.com。