Hg2+、Pb2+对牛蛙坐骨神经干动作电位阈值及传导速度的影响

李红敬+李晓杰+王雅平+李晓风

摘要：为了观察重金属离子（Hg2+和Pb2+）对牛蛙离体坐骨神经干动作电位传导速度的影响，探讨重金属离子Hg2+和Pb2+污染对两栖类动物牛蛙的作用，制备牛蛙离体坐骨神经干，分为Hg2+浸泡液浓度组（0.02、0.04、0.08、0.10、0.20、0.30 mg/L）；Pb2+浸泡液浓度组（0.08、0.15、0.20、0.40、0.80、1.00 mg/L）；Hg2+和Pb2+混合浸泡液浓度组（Hg2+ 0.064 mg/L+Pb2+ 0.080 mg/L，Hg2+ 0.048 mg/L+Pb2+ 0.160 mg/L，Hg2+ 0.032 mg/L+Pb2+ 0.240 mg/L，Hg2+ 0.016 mg/L+Pb2+ 0.320 mg/L），用BL-420F生物机能实验系统引导神经干动作电位，测定神经干动作电位阈值及传导速度。结果表明，Hg2+不同处理主要起增大牛蛙坐骨神经干阈值作用，Pb2+不同处理下牛蛙坐骨神经干阈值变化不明显，Hg2+与Pb2+联合则牛蛙坐骨神经干阈值大多表现增大且Hg2+起主要作用。Hg2+、Pb2+以及Hg2+与Pb2+联合时牛蛙离体坐骨神经干动作电位传导速度均出现不规律变化。

关键词：重金属离子；Hg2+；Pb2+；动作电位；阈值；传导速度

中图分类号：Q958.8 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）20-5316-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.037

Abstract： This study was aimed at observing the effect of heavy metal ions （Hg2+ and Pb2+） on the action potential and conduction velocity of bullfrog sciatic nerve， and researching the effect of Hg2+ and Pb2+ ions pollution on amphibians bullfrog. The prepared bullfrog sciatic nerve trunk were divided into Hg2+ groups which soaked in the liquid of concentration 0.02 mg/L，0.04 mg/L，0.08 mg/L，0.10 mg/L，0.20 mg/L，and 0.30 mg/L；the Pb2+ groups were soaked in the liquid of concentration 0.08 mg/L，0.15 mg/L，0.2 mg/L，0.40 mg/L，0.80 mg/L and 1.00 mg/L. The mixed Hg2+ and Pb2+ groups were soaked in liquid of concentration Hg2+ 0.064 mg/L+Pb2+ 0.080 mg/L，Hg2+ 0.048 mg/L+Pb2+ 0.160 mg/L， Hg2+ 0.032 mg/L+Pb2+ 0.240 mg/L and Hg2+ 0.016 mg/L+Pb2+ 0.320 mg/L. The action potential of sciatic nerve trunk was induced and detected by BL-420 system of biological function experiment. The results showed that Hg2+ presented increasing effect on the action potential threshold，while Pb2+ showed no significant effect on the action potential threshold. The joined effect of Hg2+ and Pb2+ showed increasing effect on the threshold and Hg2+ played a main role. The conduction velocity all showed irregular change whatever treated with Hg2+， Pb2+ or mixed Hg2+ and Pb2+.

Key words： heavy metal ions；Hg2+；Pb2+；action potential；threshold； conduction velocity

兩栖动物是最原始的陆生脊椎动物，既有适应陆地生活的新的性状，又有从鱼类祖先继承下来的适应水生生活的性状。同时两牺动物是农林生态系统的重要组成部分，在控制害虫和无公害农业的发展中起着重要的作用。它们的防御、扩散、迁移的能力较弱，对环境的依赖性大。近年来，大量工农业以及生活污染物的排放使生态环境受到了严重污染和破坏，给两栖类动物的生存带来了不利影响[1]。重金属元素若进入体内量过大，沉积到器官或细胞内，会使得两栖类动物在行为表现、生长发育、生理生化、形态组织等各方面发生显著变化，甚至可能导致死亡[1]。国内外许多学者研究报道了重金属离子对蛙类以及对两栖类的毒性，但有关Hg2+和Pb2+对牛蛙坐骨神经干电生理特性的影响尚未见报道。本试验测定了在Hg2+和Pb2+的胁迫下牛蛙的坐骨神经神经干电位的产生和传导特性，其目的在于了解Hg2+和Pb2+对牛蛙坐骨神经性能的影响，并为保护两牺类动物和维持生态平衡提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验用牛蛙于2013年3月采自河南省信阳市，选取体重基本一致、活性良好的牛蛙成体（雌雄不拘）置于培养箱内静养，24 h后用于试验[2]。

1.2 试验仪器

生物信号采集处理系统（BL-420F外置式，成都泰盟软件有限公司），神经屏蔽盒（成都泰盟软件有限公司）引导电极，刺激电极，联想台式计算机，常规解剖器械（解剖针、玻璃针、骨剪、镊子），烧杯，蛙板，胶头滴管，棉签，移液枪及枪头，小木块，手套，离心管或培养皿。

试验参数设置：（1）寻找阈值：单刺激（延时 5 ms，波宽0.05 ms，细电压，刺激电压0 V，增量0.05 V，主周期4 s，手动停止）。（2）测量牛蛙坐骨神经干动作电位传导速度：单刺激（延时5 ms，波宽0.05 ms，细电压，刺激电压1 V，增量0 V，主周期10 s，停止次数8）。

1.3 药品与试剂

标准任氏液配制：分析天平称取NaCl（天津市大茂化学试剂厂）32.5 g、KCl（信阳市化学试剂厂）1.4 g、CaCl2（天津市凯通化学试剂有限公司）1.2 g、NaHCO3（天津市大茂化学试剂厂）4 g、NaH2PO4（国药集团化学试剂有限公司）1 g、葡萄糖（天津市博迪化工有限公司）2 g，加蒸馏水至1 000 mL。

Hg2+和Pb2+溶液以任氏液为溶剂配制[HgCl2分析纯，相对分子质量272，Pb（CH3COO）2分析纯，相对分子质量325]。

1.4 试验方法

1.4.1 牛蛙离体坐骨神经干的制备 用常规方法制备牛蛙坐骨神经干标本。首先用天平称量牛蛙，然后左手食指按压其头部前端，右手自两眼间的中线向后划，触到凹陷的枕骨大孔，用解剖针先垂直向下再向前插入并搅动破坏脑髓，在稍微退出向后插入并搅拌破坏脊髓，直至蛙后肢及肌肉完全松弛。将蛙放在蛙板上，牵拉蛙的肚皮剪开然后在腹壁肌肉剪开翻开。从下往上数沿第三节脊柱两侧剪除一切内脏和头、胸部，保留后肢、骶脊柱及脊柱两侧的坐骨神经。然后用玻璃针、手术剪小心剥离坐骨神经。剪去坐骨神经上脊柱骨带的肉，并用棉签擦去神经上附带的血管、黏膜。

制备过程避免牵拉和用金属器械碰触到神经干以防损伤神经干。待标本制好后放入标准任氏液中平衡10 min[3]备用。

1.4.2 神经干动作电位的引导 首先将所有经标准任氏液浸泡过的坐骨神经干标本置于神经屏蔽盒的电极上，在1、5、10、15、20、25 min[4，5]时分别刺激神经中枢端由外周端导出动作电位波形，测出两引导点之间的距离（S）（测定阈值，计算动物电位传导速度，作为对照）。然后再将标本分为3组，分别置于Hg2+浸泡液[6]（0.02、0.04、0.08、0.10、0.20、0.30 mg/L）、Pb2+浸泡液（0.08、0.15、0.20、0.40、0.80、1.00 mg/L）[7]以及Hg2+和Pb2+混合浸泡液（Hg2+ 0.064 mg/L+Pb2+ 0.080 mg/L，Hg2+ 0.048 mg/L+Pb2+ 0.160 mg/L，Hg2+ 0.032 mg/L+Pb2+ 0.240 mg/L，Hg2+ 0.016 mg/L+Pb2+ 0.320 mg/L）浸泡10 min后待1、5、10、15、20、25 min时刺激神经干，分别导出动作电位波形，测出两引导点之间的距离（S），记录数据。观察牛蛙坐骨神经干经不同浓度Hg2+、Pb2+、Hg2+和Pb2+混合溶液处理后在不同时间点对其动作电位阈值和传导速度的影响。

1.5 数据处理

测量神经干接受刺激到冲动产生所需的时间（t）和两引导点之间的距离（S），计算动作电位传导速度（m/s）（计算公式：动作电位传导速度=S/t），数据均以平均值±标准差表示[8]。

2 结果与分析

2.1 不同浓度Hg2+处理牛蛙坐骨神经干动作电位阈值和传导速度

2.1.1 不同浓度Hg2+处理后牛蛙坐骨神经干动作电位阈值 由表1可见，当Hg2+浓度为0.04和0.10 mg/L时牛蛙坐骨神经干动作电位的阈值较对照减小，其他浓度处理后其阈值较对照均增加。

2.1.2 不同浓度Hg2+处理对牛蛙坐骨神经干动作电位传导速度的影响 由表2可见，不同浓度Hg2+溶液对牛蛙坐骨神经干动作电位传导速度有影响。在同一时间点，不同浓度Hg2+溶液处理与任氏液对照组比较均差异明显。同一浓度下，随着处理时间的延长，牛蛙坐骨神经干动作电位传导速度呈现不规律的变化。在5、10、15 min时均以0.20 mg/L的Hg2+溶液处理的传导速度最低。不同浓度的Hg2+处理后绝大多数在5 min时传导速度达到最低值。

2.2 不同浓度Pb2+处理后牛蛙坐骨神经干动作电位阈值和传导速度

2.2.1 不同浓度Pb2+处理对牛蛙坐骨神经干动作电位阈值的影响 由表3可见，不同浓度的Pb2+处理后牛蛙坐骨神经干动物电位阈值变化不明显，Pb2+0.08 mg/L处理后牛蛙坐骨神经干动物电位阈值增大；Pb2+ 0.15、0.40和1.00 mg/L处理后牛蛙坐骨神经干动物电位阈值无变化；Pb2+ 0.20和0.80 mg/L处理后牛蛙坐骨神经干动物电位阈值减小。

2.2.2 不同浓度Pb2+处理对牛蛙坐骨神经干动作电位传导速度的影响 由表4可见，各组相比较，1、5 min时均以Pb2+ 0.80 mg/L处理时牛蛙坐骨神经干动作电位传导速度最低；10 min时以任氏液对照组牛蛙坐骨神经干动作电位传导速度最低；15 min时以Pb2+ 1.00 mg/L处理时牛蛙坐骨神经干动作电位传导速度最低；20 min时Pb2+ 0.40 mg/L处理时牛蛙坐骨神经干动作电位传导速度最低；25 min时以Pb2+ 0.15 mg/L处理时牛蛙坐骨神经干动作电位传导速度最低。

2.3 不同浓度Hg2+和Pb2+联合处理后牛蛙坐骨神经干动作电位阈值和传导速度

2.3.1 不同浓度Hg2+和Pb2+联合处理对牛蛙坐骨神经干动作电位阈值的影响 根据前面Hg2+和Pb2+的单独试验可知在Hg2+ 0.08 mg/L和Pb2+ 0.40 mg/L时试验数据较为稳定。因此在Hg2+和Pb2+联合试验就采用Hg2+ 0.08 mg/L和Pb2+ 0.40 mg/L为母液分别配比出Hg2+∶Pb2+=8∶2，Hg2+∶Pb2+=6∶4，Hg2+∶Pb2+=4∶6，Hg2+∶Pb2+=2∶8即（Hg2+ 0.064 mg/L+Pb2+ 0.08 mg/L，Hg2+ 0.048 mg/L+Pb2+ 0.160 mg/L，Hg2+ 0.032 mg/L+Pb2+ 0.240 mg/L，Hg2+ 0.016 mg/L+Pb2+ 0.320 mg/L四个浓度梯度。

由表5可见，Hg2+和Pb2+联合处理后牛蛙坐骨神经干动物电位阈值大多数表现增大（Hg2+∶Pb2+=2∶8时牛蛙坐骨神经干动物电位阈值减小），这表明Pb2+所占比例越大牛蛙坐骨神经干动物电位阈值就减小，在Hg2+和Pb2+混合处理时主要起降低神经的灵敏度并减小阈值的作用。

2.3.2 不同浓度Hg2+和Pb2+联合处理对牛蛙坐骨神经干动作电位传导速度的影响 由表6可见，在同一时间点，不同浓度Hg2+与Pb2+混合溶液处理后牛蛙坐骨神经干动作电位传导速度与任氏液对照组相比差异明显。Hg2+与Pb2+混合溶液处理同一浓度下，随着处理时间的延长，牛蛙神经干动作电位传导速度呈不规律的变化。

3 小结与讨论

本试验应用电生理方法观察了重金属离子（Hg2+和Pb2+）对牛蛙离体坐骨神经干动作电位阈值和传导速度的影响。结果表明，Hg2+处理后牛蛙坐骨神经干动作电位阈值普遍增大，Pb2+处理后牛蛙坐骨神经干动作电位阈值的变化不明显。Hg2+和Pb2+联合处理后牛蛙坐骨神经干动作电位阈值普遍增大。随着Hg2+在联合溶液中所占比重的增大，阈值增大的趋势也越明显，说明Hg2+和Pb2+联合溶液中Hg2+起主要增大牛蛙坐骨神经干动作电位阈值的作用。

从Hg2+溶液处理后牛蛙坐骨神经干动作电位传导速度可知，不同浓度的Hg2+溶液处理后大多在5 min时动物电位传导速度达到最低。比较同一时间点，在5、10、15 min时均以0.2 mg/L Hg2+处理的牛蛙坐骨神经干动作电位传导速度最低。Pb2+溶液处理后，0.08及0.40 mg/L Pb2+处理均在20 min时动作电位传导速度达到最低。Hg2+和Pb2+联合处理下，5、20 min时Hg2+∶Pb2+=6∶4时牛蛙坐骨神经干动物电位传导速度最低；10、15、25 min时Hg2+∶Pb2+=8∶2时牛蛙坐骨神经干动物电位传导速度最低。比较联合处理同一比例下，Hg2+∶Pb2+=8∶2及Hg2+∶Pb2+=4∶6时均在25 min时动作电位传导速度最低；Hg2+∶Pb2+=6∶4时在5 min时动作电位传导速度最低；Hg2+∶Pb2+=2∶8时在1 min时动作电位传导速度最低。

目前对重金属的毒性作用已有众多的研究，但是关于Hg2+和Pb2+以及两者共同作用对牛蛙坐骨神经干动作电位的影响机制尚未见相关研究。Hg2+和Pb2+都能改变细胞酶的催化活性[9]，这可能是其影响牛蛙坐骨神经干动作电位阈值传导速度的主要原因。

参考文献：

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[4] 黄晓丽，郑慧珍，黄钿生，等.三种高渗溶液对蛙坐骨神经干动作电位的幅值及速度影响[J].广东医学院学报，2006，24（2）：119-121.

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[9] 张毓琪，陈叙龙.环境生物毒理学[M].天津：天津大学出版社，1993.18-19.